甲胎蛋白基因的转录水平检测.ppt

关于甲胎蛋白基因的转录水平检测实验目的实验方法及原理技术路线结果分析应用第2页,共19页，星期六，2024年，5月通过提取肝癌病人的癌细胞组织和癌旁组织，根据mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测肝癌病人术中切取少量新鲜的肝癌组织及癌旁1cm的肝组织，迅速至-80℃冻存。取材目的第3页,共19页，星期六，2024年，5月通过细胞RNA的提取技术，将定量的组织中的RNA提取出来，然后使用Northernblot技术，通过琼脂糖凝胶电泳、原位转移、放射自显影，测定AFPmRNA的丰度。Northernblot:（诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法。首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段原理第4页,共19页，星期六，2024年，5月细胞RNA的提取RNA的分离纯化4.RNA转移和固定琼脂糖凝胶电泳分离RNA探针分子杂交放射自显影第5页,共19页，星期六，2024年，5月TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIzol法第6页,共19页，星期六，2024年，5月匀浆处理:将组织在液氮中磨碎,100mg组织中加入1mlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。室温（15-30℃）放置5分钟。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。2-8℃10000×g离心15分钟。第7页,共19页，星期六，2024年，5月把水相转移到新管中。用0.5ml异丙醇沉淀水相中的RNA。室温放置10分钟。6.2-8℃10000×g离心10分钟，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，收集沉淀。7.用70℅乙醇洗涤RNA沉淀。至少加1ml70℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。8.得到RNA。第8页,共19页，星期六，2024年，5月RNA样品中不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除DNA分子的污染。纯化要求第9页,共19页，星期六，2024年，5月1、凝胶准备：用0.5×TBE配制2％琼脂糖凝胶。①称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml0.5×TBE；②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖；③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB0.5μg/ml，并轻轻混匀。2、胶床准备：①取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸，形成约5～8mm的挡墙。②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙。③将胶床放在调整好的水平台上。第10页,共19页，星期六，2024年，5月铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度3～5mm。室温下静置1小时左右，凝胶固化。撕去胶床两端的胶带纸，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，以越过凝胶表面1～2mm为宜。轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。第11页,共19页，星期六，2024年，5月上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般10～30μl。盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：电压1～5v/cm；时间1小时左右。电泳结束后，切断电源，取出凝胶。电泳结果分析紫外灯下观察RNA。测量从加样孔到各条带的距离。一RNA片段大小的对数值对迁移的距离作用，用得到的曲线课计算点杂交检测到的RNA大小第12页,共19页，星期六，2024年，5月Northern印迹又称RNA印渍术，是将存在于凝胶中的RNA分子转移（印渍）于固定化介质(如：硝基纤维素膜)上并加以检测分析的技术，可以用合成的寡核苷酸片段作为探针，也可以用克隆或提取的DNA片段作为探针进行标记，特点专一性好，假阳性率低，用于RNA水平分析等。第13页,共19页，星期六，2024年，5月取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。室温下将胶浸到0.1mmol/LTrisHCl(pH7.5)中45min,使胶中和。20×SSC