手足口病实验诊断.pptVIP

病毒核酸检测—RT-PCR?RT-PCR(ReverseTranscriptasePCR)用于RNA病毒的检测，酶促催化使RNA逆转录成cDNA第一链，逆转录与第一次PCR在同一系统内进行，逆转录完成后，加热灭活逆转录酶，然后开始PCR扩增。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与mRNA杂交，然后由依赖RNA的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。快捷、简便22%具有病原诊断意义40%高度灵敏、特异38%方法特点：高效的通用型技术平台68%病毒核酸检测—RT-PCRSTEP3STEP2STEP1粪便标本：采用氯仿进行处理。肛拭子/咽拭子标本：咽拭子要在标本保存液中充分搅动，然后在4℃下，10000rpm离心20min。疱疹液和脑脊液：直接用于RNA提取。标本的预处理可使用商业化试剂盒从临床标本中提取病毒RNA简化操作、规范方法、条件一致、排除干扰QIAGENViralRNAMiniExtractionKit（CAT：52904）适合临床标本和病毒培养物标本QIAGENRneasyMiniKit（CAT：74104）适合组织和咽拭子标本RNA的提取引物人肠道病毒（包括EV71、CA16、CA24v、EV70）核酸检测通用引物PE2（上游）：5`-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3`PE1（下游）：5`-ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTCC-3`EV71核酸检测引物序列：EV71-S（上游）：5`-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3`EV71-A（下游）：5`-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3`引物CA16核酸检测引物序列：CoxA16-S（上游）：5`-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3`CoxA16-A（下游）；5`-TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG-3`引物***********手足口病的实验诊断安徽省疾病预防控制中心2009.3.11手足口病（hand-foot-mouthdisease,HFMD）由人肠道病毒感染引起。1人肠道病毒为小RNA病毒科（Picornaviridae），肠道病毒属（Enterovirus）的一组单股正链RNA病毒。其中包括埃可病毒（31个血清型）、柯萨奇病毒A组（23个血清型）和B组（5个血清型），还包括3个脊髓灰质炎病毒血清型和人肠道病毒68-71型。2手足口病的病原~30nm二十面体对称无包膜CourtesyofLindaM.Stannard,UniversityofCapeTown,S.A.h人肠道病毒的毒粒结构脊髓灰质炎病毒：1909年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。埃可病毒：1951年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。123新肠道病毒：随后新发现的病毒被按照序号命名（69~71），最近，已经命名至102型4人肠道病毒发现的历史肠道病毒主要血清型多种肠道病毒都可引起HFMD，主要为：柯萨奇病毒A组的4～7、9、10、16型B组的1～3、5型埃可病毒的部分血清型肠道病毒71型最常见的为CV-A16和EV7112手足口病的常见致病病原3241肠道病毒无包膜，乙醚、75%酒精、表面活性剂等均不能将其灭活。病毒RNA有感染性。对紫外线及干燥敏感；各种氧化剂（高锰酸钾、漂白粉等）、甲醛或56℃30min都能灭活病毒病毒在4℃可存活1年，-20℃可长期保持感染性肠道病毒的抵抗力采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（一）粪便标本1（二）脑脊液标本出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内，采集量为1.0～2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保