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饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检测

1范围

本标准规定了饲用微生物制剂中凝结芽孢杆菌的检测方法。

本标准适用于含有益微生物凝结芽孢杆菌的各种饲料添加剂中凝结芽孢杆菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008/ISO3696：1987，MOD）

GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定

GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1-2005/ISO6497：2002，IDT）

GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20195-2006/ISO6498：1998，IDT）

3培养基和材料

实验用水参照标准：分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008/ISO3696：1987，MOD）

3.10.85%灭菌生理盐水

3.2自制改良营养琼脂培养基(NA)：参见附录A中的A.1

3.3革兰氏染色液：参见附录A中的A.2

3.4细菌生化鉴定试剂盒

3.5细菌基因组DNA提取试剂盒

3.6标准菌株：凝结芽孢杆菌CICC21736

4主要仪器设备和玻璃器皿

4.1恒温培养箱：50℃±1℃

4.2恒温水浴锅：80℃±1℃

4.3普通冰箱

4.4天平：感量为0.1g、0.01g、0.0001g

4.5振荡器或漩涡混合器

4.6显微镜：1000倍

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4.7pH计：精确度0.1

4.8无菌玻璃或塑料培养皿Φ=90mm、无菌锥型瓶、无菌玻璃或塑料涂布棒

4.9量筒：250mL

4.10PCR仪

4.11电泳仪

4.12凝胶成像仪

4.13移液器：量程10μL、100μL、1000μL、10000μL

5检验程序

凝结芽孢杆菌检验程序见下图。

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6采样

采集样品真实，具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应为无菌器皿。样品采集后置于4℃~8℃环境内保存，并应及时送到微生物检验室进行检测。采样数量和方式按GB/T14699.1执行。

7试样的制备

按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应及时检验。

8试验步骤

8.1检样制备、初始悬液和10倍稀释

以无菌操作称取试样25.0g(mL)，注入盛有225mL0.85%灭菌生理盐水的锥形瓶中。置振荡器上，设置参数37℃、185r/min，振荡60min，制成1：10的初始悬浮液，水浴80℃±1℃维持10min。吸取1：10的初始悬浮液1mL，加入9mL0.85%灭菌生理盐水，经充分混匀后制成1：100的稀释液。根据样品含菌量，按上述操作顺序做10倍递增稀释液。

8.2接种和培养

选择2个适宜稀释度，每个梯度2个平行，用无菌移液器分别吸取0.1mL稀释液，接种到自制改良营养琼脂培养基(NA)上。使用无菌的涂布棒快速、准确地涂布接种于培养基表面，涂布棒不应接触平皿边缘。每个平皿用一支无菌涂布棒。将涂布好的平皿盖好，置室温中放置15min，使菌液浸入培养基，倒置于50℃±1℃培养箱中培养24h±1h。

8.3菌落计数

培养后，选取菌落数在30个～300个之间的平板计数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。典型的凝结芽孢杆菌菌落形状不规则，无隆起，呈灰白色，不透明。然后从中选出5个特征菌落进行确证试验。

8.4确证试验

8.4.1概述

目前商品化的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基一致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管以进行该项确证试验。目前商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，如果符合本标准确证试验的要求，可以按照商品说明书使用这些细菌基因组DNA提取试剂盒或常用方法以进行该项确证试验。

8.4.2菌种制备

自凝结芽孢杆菌菌落计数平板上挑取不透明，灰白色单菌落，划线转接培养于自制改良营养琼脂培养基(NA)（A.1）上，50℃±1℃培养24h±1h。从每一平板中选取至少1个良好分离的特征菌落，转接保存，进行确证试验。

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8.4.3形态观察

将挑选