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实时荧光定量PCR技术的原理及应用前沿
(RealtimeQuantitativePCR)
北京天为时代科技有限公司
主要内容
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR的几种方法介绍
在生物学研究中的应用前沿
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析
无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每
一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线
的分析对起始模板进行定量分析
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
扩增曲线、荧光阈值、Ct值
荧光检测元件
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度
每个循环进行一次荧光信号的收集
：
前15个循环信号作为荧光本底信号
性对照的荧光值
荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置：原则要大于样本的荧光背
回归系数大于0.99
真正的信号:荧光信号超过域值
Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈
值时所经过的扩增循环次数
C(t)value
Ct值的重现性
纵
轴
：
荧
光
信
号
量
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒
定；
Ct值则极具重现性
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小
可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模
板量
确定未知样品的C(t)值
确定未知样品的C(t)值
通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
Sample
25
1、SYBRGreen
2、TaqMan
3、MolecularBeacon
4、Amplisensor
R
SYBRGreen
SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位
SYBR
S
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