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灵芝免疫调节蛋白在鬼伞中的表达

刘志明李昭萍冯燕芬

摘要：从现有载体CA_ACB_GFP出发，构建出LZ－8灰盖鬼伞表达载体，并利用PEG法将目的基因转化灰盖

鬼伞受体细胞，通过氨苄青霉素抗性来筛选转化子。最后提取转化子的基因组，进行PCR初步鉴定，得到若干

个可能含有目的基因的灰盖鬼伞转化子。

关键词：灰盖鬼伞灵芝免疫调节蛋白真核表达

灵芝免疫调节蛋白是灵芝来源的一类具有免疫调节活性的蛋白的统称。1989年日本学者Kino

等人从赤芝（Ganodermalucidum）菌丝体中分离到一种免疫调节蛋白，命名为LZ-8蛋白。Kino

等人的研究还指出，该蛋白在体外具有凝集活性和促有丝分裂原活性，但并非植物凝集素；在体

内主要表现为免疫抑制作用，能抑制系统性过敏反应和Arthus反应，以及能阻止糖尿病小鼠（NOD

小鼠）胰腺炎的发生。MiyasakaN等人的研究发现，LZ-8能通过调节粘附分子而促进细胞间相互

作用。TanakaS等人的研究表明：LZ-8的氨基酸序列及预测的二级结构均与免疫球蛋白分子重链

的可变区有很多相似性而表现出免疫调节作用，具有潜在的临床价值。

本研究的目的是构建出LZ－8灰盖鬼伞表达载体，以获得高效表达灵芝免疫调节蛋白的真核

工程菌株。为以后该蛋白的工业化生产和大规模应用打下基础。

1实验材料与仪器

1.1材料

载体CA_ACB_GFP、TEasy-LZ-8、灰盖鬼伞菌种均由实验室提供

1.2主要试剂

Taq酶、dNTP，购自上海申能博彩生物科技有限公司；

SalⅠ、NcoⅠ，均购自北京赛百盛基因技术有限公司；

BsrGⅠ,购自纽英伦生物技术有限公司

T4DNA连接酶购自Promega公司；

DNAmarkerⅢ，购自北京天为时代科技有限公司；

3SSpinAgaroseGelDNAPurificationKit购自申能博彩生物科技有限公司；

1.3仪器设备

恒温金属浴CHB-100，杭州博日科技有限公司；

微量离心机，Eppendorf5417C；

超净工作台，苏净集团安泰公司；

基因扩增仪，ThermoElectronCorporation；

低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；

FM70制冰机，上海格兰特公司。

2方法

2.1构建LZ－8灰盖鬼伞表达载体

2.1.1具体方法

1.用限制性内切酶NcoⅠ和BsrGⅠ对载体CA_ACB_GFP进行双酶切，去除GFP（绿色荧光蛋白）

基因片断，回收大片锻。

酶解反应体系如下：

10×reactionbufferB5.0μL

BsrGⅠ（10u/μL）2.2μL

NcoⅠ（10u/μL）1.8μL

ddHO31.0μL

2

1

plasmid10.0μL

totalvolume50.0μL

各试剂混匀后，置于37℃水浴中，酶解11hr，以1％凝胶电泳分离酶解产物，采用3SSpin

AgaroseGelDNAPurificationKit回收从琼脂糖凝胶中割取目的大片段，操作步骤按说明书进行。

2.以质粒TEasy-LZ-8为模板，利用上下游引物

P1：GAAGCTTATGTCCGACACTGCCTTG，

P2：GCTGCAGGCAGATAGAACAAG，

扩增LZ－8基因片断。

PCR反应体系：

10Buffer50μL

25mMMgCl23.2μL

ddHO28.4μL

2

dNTP