朱鹮肺炎克雷伯菌双重PCR检测技术规程.docx

ICS07.100

CCSB05

DJG330521

德清县地方技术性规范

DJG330521/T110—2024

朱鹮肺炎克雷伯菌双重PCR检测技术规程

Codeofpracticeformultiplex-PCRdetectionofKlebsiellapneumoniaefromthecrestedibis

I2024-11-01发布2024-12-01

I

德清县市场监督管理局发布

DJG330521/T110—2024

I

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4缩略语 1

5试剂、仪器及材料 1

6PCR鉴定 2

7废弃物无害化处理和人员安全防护 3

附录A（资料性）培养基制备 4

附录B（资料性）试剂制备 5

附录C（资料性）参考序列 6

参考文献 7

DJG330502/T110—2024

II

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由德清县自然资源和规划局提出并归口。

本文件起草单位：浙江农林大学、德清县生态林业综合服务中心（德清县湿地和野生动植物保护管理站）、湖州市生态林业保护研究中心。

本文件主要起草人：邱国强、张辉、杨永春、宋厚辉、陆璐彬、李颖、石坚、牛冬、段润、陈严雪、李元春、马翔、刘寒、朱炜、陈梦娇、熊艳云、王丹、耿学进、陆行舟、代雯雯、徐新泉、仲建平。

DJG330521/T110—2024

1

朱鹮肺炎克雷伯菌双重PCR检测技术规程

1范围

本文件规定了朱鹮肺炎克雷伯菌和拟肺炎克雷伯菌的双重PCR检测方法。

本文件适用于朱鹮组织病料和粪便等样本中肺炎克雷伯菌和拟肺炎克雷伯菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则

3术语和定义

3.1

肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae

肺炎克雷伯菌，为革兰氏阴性短杆菌，成双或短链状排列，无芽胞，无鞭毛，不运动，有明显荚膜，广泛存在于自然界、人和动物的肠道、上呼吸道，是重要的人畜共患条件性致病菌，可引起肺炎、尿路感染、肝脓肿、败血症等感染性疾病，包括拟肺炎克雷伯菌(Klebsiellaquasipneumoniae)与肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)等亚种。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）。DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）。

5试剂、仪器及耗材

5.1试剂及耗材

灭菌蒸馏水（应符合GB/T6682中一级水的规格）、蒸馏水、缓冲葡萄糖黄绿胆盐肉汤（EE肉汤，见附录A）、50×TAE电泳缓冲液（配置见附录B）、1×TAE电泳缓冲液、2×KODDyeMix、DNAMarker、琼脂糖、10000×GelRed核酸染色剂、Tris、Na2EDTA·2H2O、醋酸、1.5mL离心管、PCR反应管、细菌基因组DNA提取试剂盒。

5.2设备

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2

可调移液器（量程分别为0.1μL-2.5μL、1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1000μL）、恒温培养箱（37℃)、PCR扩增仪、凝胶电泳仪（150V）、凝胶成像仪、超净操作台、酒精灯、高速离心机（离心力12000g）、电子天平（量程0g-500g，感量0.1g）、冰箱（4℃-20℃)、高压灭菌锅（121℃)、精密pH试纸。

5.3PCR扩增引物

肺炎克雷伯菌脂多糖合成基因WaaQ，拟肺炎克雷伯菌β内酰胺酶基因Bla及其染色体基因DeoR扩增引物及其序列见表1。

表1PCR引物序列及目的片段长度

引物名称