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第六章

分子生物学基本研究法

（下）基因功能研究技术;6.1基因表达研究技术

6.1.1转录组学研究

转录组(transcriptome)，广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA(non-codingRNA或siRNA)。

现常指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。;基因组－转录组－蛋白质组（genome－transcriptome－proteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。

通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。;传统的转录组研究方法主要包括：表达序列标签（expressedsequencetag，EST）测序技术，基因表达系列分析技术（serialanalysisofexpression，SAGE）和基因芯片技术。

EST测序数据是目前数量最多，涉及物种最广的转录组数据，但测序读长较短（每个转录本测定400bp－500bp），测序通量小，测序成本较高，而且无法通过测序同时得到基因表达丰度的信息。;SAGE测序法：将不同转录本3’端第一个CATG位点下游14bp长的短标签序列来标识相应的转录本。由于标签序列较短，可以将多个标签串联测序，使SAGE法相对于EST测序在通量上大大提高。但过短的序列标签使得序列唯一性降低，即使改进过的LongSAGE用21bp标签测序，仍然有约一半的标签无法被准确注释到基因组上。;高通量测序技术(high-throughputsequencing)，又名二代测序（second-generationsequencing）或深度测序(deepsequencing)，可以一次性测序几十万甚至几百万条，是传统测序技术的革命。

利用高通量测序技术对转录组进行测序分析被称为RNA-Seq，对测序得到的大量原始读长（reads）进行过滤、组装以及后续的生物信息学分析。;表6-1454和Illumina高通量测序平台比较;454

Illumina

测序原理示意图;454系统采用焦磷酸测序(pyro-sequencing)：按T、A、C、G顺序加入单个dNTP与模板配对，释放一分子焦磷酸(PPi)，在ATP硫酸化酶作用下PPi和腺苷酰硫酸（adenosine-5’-phosphosulfate,APS）结合形成ATP，在萤光素酶的催化下产生可见光。

454则由于缺少终止反应的元件，相同碱基的连续掺入常会带来“插入???缺失”类型的测序错误。;Illumina测序系统采用萤光标记dNTP，其3’羟基末端可被化学切割，每个循环反应只允许掺入一个碱基，由激光扫描反应板表面，读出这一轮反应新加的萤光信号，从而判定碱基种类。之后，经过化学切割恢复3’端粘性，进行下一轮聚合反应。

随着Illumina的测序反应的进行，已有萤光信号会使新的萤光难以准确分辨，因此该方法的测序读长较短，测序错误主要是碱基替换。;6.1.2RNA的选择性剪接

RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。包括：

平衡剪接、5’选择性剪接、3’选择性剪接、外显子遗漏型剪接及相互排斥性剪接。;图6-2选择性剪切的不同类型;图6-3RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切;图6-4果蝇（Drosophilamelanogaster）的Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体;6.1.3原位杂交技术

原位杂交(InSituHybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。;RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。

用mRNA的互补链为探针进行杂交。

负对照，mRNA的同义链,无杂交信号。;廖芯倾祷宴俺垄逞占润观渡萝悉缎蛹雹寓制福茬狈瓦浴赊淘愈柬寂寅冤蠢molecularbiology-06molecularbiology-06;荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH).

对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过