岷江百合灰霉菌诱导咖啡酸-O-甲基转移酶(LrCOMT)基因克隆与功能分析.pdf

摘要

摘要

百合是集药赏食作用于一体的重要花卉植物，作为目前销量最高的五大鲜切花之

一，具有较高的经济价值。由于灰霉病的严重侵染，严重影响百合生产销售，造成巨

大的经济损失。岷江百合作为一种野生百合资源，因其对干旱、真菌和病毒的良好抗

性而闻名，它的抗逆基因也继而被关注并运用到培育抗病新品种的研究中。目前，关

于岷江百合抗病基因的克隆与功能表达分析的研究报道相对较少，特别是在木质素生

物合成途径中涉及的抗灰霉病相关基因。本研究利用灰霉菌孢子侵染岷江百合叶片并

进行转录组测序，筛选克隆获得差异表达的LrCOMT1和LrCOMT2基因，通过生物

qRT-PCRRT-PCR

信息学分析、亚细胞定位、、、构建过表达载体和反义表达载体、

拟南芥遗传转化、百合叶片瞬时转化以及木质素含量测定等方式对其表达和功能进行

初步分析，通过定量分析LrCOMT1和LrCOMT2过表达对木质素生物合成途径及

SA/MeJA抗病信号通路标志基因的表达情况，从而阐明岷江百合LrCOMT1和

LrCOMT2基因在灰霉菌应答过程中的生物学功能并初步探究其作用机制。主要研究

结果如下：

1.LrCOMT1和LrCOMT2蛋白结构均以无规则卷曲为主，占比分别为67.64%

和63.23%。三级结构分析中，LrCOMT1蛋白以序列同一性为38.17%的(S)-去甲乌

6-O-LrCOMT254.44%

药碱甲基转移酶为模板进行同源建模，蛋白以序列同一性为

的O-甲基转移酶为模板，并均以2聚体结构形式发挥蛋白功能。保守结构域预测

显示LrCOMT1蛋白含保守结构域dimerization2superfamily和AdoMet_MTases

superfamilyLrCOMT2dimerizationAdoMet_MTasessuper

，蛋白于含保守结构域和

family。

2.通过多序列比对和进化树分析发现，LrCOMT1基因不仅与COMT家族相关，

还与AtASMT1基因的进化过程相近，而LrCOMT2基因与COMT家族以及AtCOMT1

的进化关系相近；同时通过荧光定量分析发现岷江百合LrCOMT1和LrCOMT2基

因在灰霉菌孢子处理4h后的表达水平显著上升；由此推测LrCOMT1基因和

LrCOMT2基因均可能通过木质素生物合成途径抵御灰霉菌的侵染，而LrCOMT1

基因可能还参与其他途径。

3.通过对岷江百合叶片进行外源激素SA和MeJA胁迫处理，分析LrCOMT1和

LrCOMT2基因在岷江百合上的诱导表达情况。结果表明，LrCOMT1基因对外源激

素MeJA的响应相对于SA处理更加明显，在MeJA处理24h后，LrCOMT1基因

表达水平显著上调并升至峰值；而LrCOMT2基因对外源激素SA处理相较于MeJA

SA12hLrCOMT1

处理的表达量上调更加明显，在处理后达到峰值。

I

重庆三峡学院硕士学位论文

和LrCOMT2基因在岷江百合不同组织中的表达情况显示，两个基因均在老茎中的

表达量最高，其次为外鳞茎，在根部中的表达量最低。LrCOMT2基因在亚细胞定

位结果表明，LrCOMT2-GFP融合蛋白的荧光信号仅在细胞核和细胞膜中进行表达。

4.通过构建LrCOMT1和LrCOMT2基因的过表达载体，并利用蘸花法获得异

TGUS

源过表达的转基因拟南芥，筛选至代纯和的转基因植株经