HPLC安捷伦高效液相使用维护常见问题精品医学课件.pptVIP

分析方法的建立及验证准确度：用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。1、原料药含量测定：回收率（%）=测得量/加入量×100%--空白基质中加入药品2.制剂的含量测定：标准加样回收---已知浓度样品中加入药品数据要求:在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。例如，设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。分析方法的建立及验证绝对回收率=提取回收率/（1－基质效应），HPLC中基质效应为01.绝对回收率=提取回收率=萃取回收率，是用药品加血浆经萃取处理后的进样峰面积除以该药品溶液直接进样峰面积的比值，一般来说，该比值不可能超过100%，能做到80%就不错了。以前国家对绝对提取率还有些要求，现在随着lc-ms的应用，最低定量限已经能做到很低，也就不需要再对绝对回收率提具体要求，只要相对回收率满意就可以。--生物样品:用于筛选提取溶剂，可以低但要稳定

2.相对回收率=方法学回收率，是血浆处理后的进样峰面积代入血浆标准曲线，计算所得浓度除以真实血样浓度.该比值在100%左右.一般要求高、中浓度点在15%以内，低浓度点可适当放宽。--内标的相对回收率值与绝对回收率要求类似

(1)举例:10ngA药加入1ml空白血浆（10ng/ml），经萃取处理后用0.5ml流动相复溶，进样所得峰面积8000;配制对照溶液（浓度10ng/0.5ml=20ng/ml），进样所得峰面积假设为10000.那么萃取回收率为8000/10000=80%.

(2)举例:上述经萃取处理的血浆溶液（10ng/ml）峰面积8000，代入标准曲线计算，假如计算所得浓度为8.5ng/ml,相对回收率则为8.5/10=85%.分析方法的建立及验证精密度：在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，一般用SD.RSD表示。1、重复性：在较短的时间间隔内，在相同的操作条件下，由同一分析人员连续测定所得结果的精密度，也就是日内（批内）精密度（RSD限度：生物制品5％，药品2％）2、中间精密度：同一实验室不同时间不同分析人员用不同设备测定所得结果之间的精密度。其中，由同一分析人员用同一设备在不同时间测定所得结果通常称为日间（批间）精密度(RSD限度:生物制品15％，药品5％)3、重现性：不同实验室不同分析人员测定结果之间的精密度（基本不做）制备3个不同浓度的样品,每个浓度各3份（对照品）100%水平的供试品溶液,至少测定6次的结果进行评价HPLC的使用、维护及方法学的建立*HPLC基本原理和特点液相色谱仪器部件实验操作与应用日常维护方法学的建立基本原理和特点基本原理:溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用(吸附，分配，离子吸引，排阻，亲和)的大小，强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。特点:分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。HPLC的分类按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。?正相色谱法:采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（如正已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物。?反相色谱法:一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂，极性物质先出。高效液相色谱仪组成输液系统进样系统分离系统检测系统数据记录处理系统溶剂色谱泵自动进样器HPLC色谱柱检测器废液数据处理系统液相色谱流程图一些商品化仪器脱气装置四元泵柱温箱样品盘检测器流动相溶剂

棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。

经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。启动液相色谱仪器的流程开启HPLC系统各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器电源，打开计算机启动“1260联机工作站”，待工作站图形颜色为绿色—表明仪器已就绪。排气泡打开排气阀，将流速调至5ml/min，排气5min；待流速降为0，拧紧排气阀。80%甲醇（过滤、超声15min）冲洗系统使用80%的甲醇溶液冲洗系统至少30min，流速为1ml/min，待基线平稳即可进行下一步操作。注意:观察柱压是否稳定，若不稳定出现大幅度柱压下降现象，很有可能是系统发生漏液，优先排