LAMP微流控芯片即时检测骨髓增殖性肿瘤分子标志物.ppt

第二部分研究工作3D示意图研究方法与结果-聚丙烯丝束/毛细管提取基因组DNAQubit定量5μl全血：50±2.5ng；10μl全血：81±4.2ng；20μl全血150±5.8ng15分钟内完成采血、基因组DNA提取基因组DNA具有完整性授权专利：一种快速提取全血基因组DNA的装置（ZL201510532629.5）研究方法与结果-便携式微型温控仪温控仪设计图温控仪实物图温控仪控制温度为37～100°C，控制精度≤±0.3研究方法与结果-MPLW515K/L引物设计及验证W515k引物特异性扩增W515K突变质粒W515L引物特异性扩增W515L突变质粒可视化检测（515K引物）（515L引物）515K突变质粒515L突变质粒W515野生型引物特异性扩增W515野生型质粒研究方法与结果可视化检测515野生型引物515野生型质粒研究方法与结果-MPLW515K/L引物设计及验证实时浊度法W515k引物特异性扩增W515K突变质粒W515L引物特异性扩增W515L突变质粒研究方法与结果-MPLW515K/L引物设计及验证实时浊度法W515野生型引物特异性扩增W515野生型质粒方法与结果-MPL515K/LLAMP产物测序515LTGG-TTG515KTGG-AAG方法与结果-MPL515KLAMP产物酶切鉴定方法与结果-MPL515LLAMP产物酶切鉴定设计及制作检测MPN多个分子标志物的LAMP微流控芯片μmLchip：ALAMPmicrochipforsimultaneousmulti-genemutationscreeninginpatientwithMPN）检测基因检测槽道阳性对照槽道V617F野生型1P1V617F突变型2P2W515K突变型3P3W515L突变型4P4W515野生型5P5N,阴性对照；P,阳性对照；N*,空白对照μmLchipμmLchipA，SU-8阳模；B，μmLchip实物图研究流体控制的芯片流体控制芯片A,SU-8阳模；B,芯片实物图检测基因突变率的微流控芯片灵敏度检测微流控芯片A，SU-8阳模；B，芯片实物图芯片流体控制研究矿物油阀控制LAMP芯片流体A，加热前；B，65℃加热1小时后LAMP微流控芯片检测基因突变灵敏度分析A,W515K（0.1%）；B,W515L（0.1%）；V617F（0.01%）方法学准确度分析本室自建方法作为参考方法非标记探针HRM分析JAK2V617F突变，荧光定量PCR分析MPLW515K/L突变临床样本：30例ET患者，10例PMF患者ET患者：12例JAK2V617F突变阳性，1例MPLW515K突变阳性（同时伴JAK2V617F突变阳性，1例MPLW515L突变阳性。PMF患者：4例JAK2V617F突变阳性，1例MPLW515L突变阳性。μmLchip与参考方法基本一致对1例未确认样本（μmLchip：JAK2V617F突变阳性；非标记探针HRM法：阴性）进行亚克隆测序，测序结果确定此标本存在JAK2V617F突变。μmLchip检测结果模式JAK2V617F突变型MPLW515K突变型MPLW515L突变型μmLchip检测结果MPL515K和JAK2V617F同时突变型第二部分小结聚丙烯丝束/毛细管国家发明专利：一种快速提取全血基因组DNA的装置和方法申请号：201510532629.5实用新型专利：一种快速提取全血基因组DNA的装置专利号：ZL201510532629.5便携式微型温控仪μmLchip:JAK2V617F、MPLW515K/L同步即时检测*我们研制了一款特殊毛细管，填充聚丙烯丝束可实现末梢血基因组DNA的快速提取，毛细管采用橡胶滴头控制流体。B为扫描电镜表征聚丙烯丝束，其表面具有多孔隙结构，采用乙醇沉淀法对末梢血基因组DNA进行提取C为毛细管从5、10和20微升全血中提取的基因组DNA凝胶电泳结果，均为50kb大小的单一条带，显示了基因组DNA良好的完整性。Qbit2.0荧光计分析，在15分钟内毛细管分别从5、10和20微升全血中提取出50、81和150ng的基因组DNA。结果显示，毛细管提取的DNA满足后续的芯片等温扩增反应。此部分工作，我们已获一项实用新型专利*下一步工作我们研制了一款便携式微型温控仪，可实时给LA