细胞免疫荧光技术.ppt

关于细胞免疫荧光技术实验目的掌握免疫荧光技术的基本原理熟悉细胞免疫荧光技术的方法了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果第2页,共17页，星期六，2024年，5月实验原理原位检测抗原抗体特异反应间接法间接荧光抗体染色法示意图抗原抗体荧光素标记的抗抗体激发光显示荧光Hela细胞Vinculin第3页,共17页，星期六，2024年，5月实验用品试剂：固定液：4%PFA细胞通透：0.2%TritonX封闭试剂：10%正常山羊血清一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体二抗:AlexaFluor555标记的山羊抗小鼠IgGDAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）PBS洗涤缓冲液：PH7.4材料：Hela细胞细胞培养皿仪器：荧光显微镜第4页,共17页，星期六，2024年，5月实验步骤一，细胞制备和细胞固定将细胞铺在24孔板中将细胞培养至所需密度加入4%PFA固定10min染色或保存PBS洗涤PBS洗涤第5页,共17页，星期六，2024年，5月实验步骤二，细胞免疫荧光ICC染色0.2%TritonX处理5min封闭室温30min4℃过夜37℃1-2小时37℃5-10min荧光显微镜观察加入一抗加入二抗加入DAPI复染PBS洗涤PBS洗涤PBS洗涤第6页,共17页，星期六，2024年，5月实验结果三，观察?humanHeLacells第7页,共17页，星期六，2024年，5月实验中应注意的问题细胞不要铺的过密:60-70%防止细胞污染固定时间不要太长,一般10-30minTrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理选择合适的封闭液二抗孵育后,一定要洗干净必要时用恒温摇床摇洗第8页,共17页，星期六，2024年，5月1.免疫荧光技术2.免疫酶技术3.免疫亲和技术4.胶体金技术标记物使抗体或抗原抗体复合物在各种显微镜下可见的物质免疫细胞化学技术第9页,共17页，星期六，2024年，5月免疫细胞化学技术注意事项选择合适的方法材料要留好选择抗体选择标记酶封闭液的选择设定对照实验第10页,共17页，星期六，2024年，5月思考题检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法，用什么仪器观察？A第11页,共17页，星期六，2024年，5月疑难解答一，缺乏染色可能的原因无抗原抗体失效固定不充分过度固定抗原修复无效不兼容的二抗和一抗漏用试剂或未按正确的顺序加入试剂相应的措施用原位杂交方法检测蛋白表达按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融增加固定时间或改用不同的固定剂减少固定时间;抗原修复增加修复时间或更换修复液使用可以与一抗结合的二抗重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序第12页,共17页，星期六，2024年，5月二，高背景第13页,共17页，星期六，2024年，5月可能的原因一抗或二抗的浓度过高一抗和/或二抗与组织的非特异性结合组织过于干燥试剂粘附在旧的或未制备好的玻片上相应的措施预实验摸索最佳浓度一抗孵育前封闭(最好是二抗来源的血清)在染色过程中避免组织干燥用新鲜制备或购买的玻片进行实验第14页,共17页，星期六，2024年，5月三，细胞/组织的形态被破坏第15页,共17页，星期六，2024年，5月可能的原因抗原修复方法过于剧烈组织切片从玻片上脱落组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡组织形态难以分辨组织固定不充分,自发裂解相应的措施预实验摸索合适的修复条件增加固定时间;烤片;使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水及时固定;增加固定时间;提高固定剂/组织的比例;将组织切得较小第16页,共17页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第17页,共17页，星期六，2024年，5月*Vinculin,是一种细胞骨架蛋白，兼细胞黏着斑蛋白的重要成分,主要分布于细胞与细胞连接，细胞与细胞外基质黏着斑部位，通过与细胞骨架蛋白和黏着斑蛋白以及细胞骨架F肌动蛋白相互作用，