生物化学实验技能及基本训练102.pptx

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生物化学实验技能及基本训练

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第一部分

生物化学实验

基本技术

一、离心分离技术

1.离心分离原理

离心是指利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力、密

度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。

颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。

按转速不同可将离心机分为常速、高速和超速3类

一、离心分离技术

2.离心分离基本方法

1.差速离心法

2.速率区带离心

3.等密度梯度离心

二、分光光度技术

1.分光光度计的基本原理

分光光度计进行比色分析的基本原理是根据朗伯一比尔

（Lambert-Beer）定律，这个定律是讨论有色溶液对单色光的

吸收程度与溶液浓度及液层厚度间的定量关系，公式为E=kcL式

中：

E一一消光度（光密度OD，吸光度A);

K-－消光系数，仅与入射光波长有关；

c一一溶液浓度；

L一一液层厚度。

二、分光光度技术

2.分光光度检测的基本方法

(1）样品溶液的配制：对紫外光、可见光或红外光有选择性吸收特性的物质，只需

选择适当的溶剂配制成一定浓度范围的样品溶液即可进行分光光度检测。

二、分光光度技术

2.分光光度检测的基本方法

(2）样品检测与定性、定量分析：根据待测物质的吸收光谱特性，选择好入射光线

的波长，用蒸馆水或空白液调节好零点，即可进行样品的检测。

欲确定待测物质，有下列3种方法。

1）将样品溶液在一定条件下（pH、温度、缓冲液等）的吸收光谱（吸光度－波长

曲线）与物质的标准吸收光谱（有关手册可以查到）相对照，借以推断样品属于什

么物质。

二、分光光度技术

2.分光光度检测的基本方法

(2）样品检测与定性、定量分析：根

据待测物质的吸收光谱特性，选择好

入射光线的波长，用蒸馆水或空白液

调节好零点，即可进行样品的检测。

欲确定待测物质，有下列3种方法。

2）根据吸收光谱中峰顶与峰谷吸光度

比值与相当条件下资料所载的比值相

比较，推断样品是何物质。

例如：

ATP:OD280/OD260=0.85

OD250/OD260=0.90

AMP:OD250/0D260=0.85

OD280/0D260=0.22

二、分光光度技术

2.分光光度检测的基本方法

(3）用分光光度法测定注意事项

1）分光光度计滤光性能。

2）吸光度值应控制在0.05~1.0。3）

正确选用参比溶液，当显色剂及其他

试剂均元色而被测溶液中又元其他离

子时，可用蒸馆水作参比溶液；如显

色剂本身具有颜色，则用显色剂作对

照。

三、电泳技术

各种生物大分子在一定pH条件下，可以成为带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用

下向相反电极移动的现象称为电泳。电泳技术广泛应用在生化物质的分析检测中。

1.电泳基本原理

三、电泳技术

各种生物大分子在一定pH条件下，可以成为带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用

下向相反电极移动的现象称为电泳。电泳技术广泛应用在生化物质的分析检测中。

2.常用的电泳技术

(1）薄膜电泳：

(2）薄层电泳:

(3）凝胶电泳：

四、层析分离技术

层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异

（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等）

尽管各种层析的原理和操作有所不间，但其基本步骤是相同的，包括选择适当的层析材

料、上样（点样）、洗脱（展层）、检测鉴定等4个环节。

(1）柱层析法：

四、层析分离技术

尽管各种层析的原理和操作有

所不间，但其基本步骤是相同

的，包括选择适当的层析材料、

上样（点样）、洗脱（展层）、

检测鉴定等4个环节。

(2)纸层析法：纸层析法又称

纸色谱法，是以纸为载体的色

谱法。

四、层析分离技术

(2)纸层析法：纸层析法又称纸色谱法，是以纸为载体的色谱法。

1）原理

纸层析法是依据极性相似相溶原理，以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂作为流

动相的分离方法

2）操作方法。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂展开，最后形成

互相分离的斑点。

四、层析分离技术

(3）离子交换层析法：

离子交换层析法是以具有离子交换性能的

物质作固定相，利用它与流动相中的离子

能进行可逆的交换来分离离子型化合物的

一种方法。

基本原理：

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树

脂或纤维素组成。带有正电荷的称之为阴

离子交换树脂，带有负电荷的称之阳离子

交换树脂。

四、层析分离技术

(4)凝胶层析法：凝胶层析法适用于分离和

提纯蛋白质、酶、多肽、