聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质.ppt

关于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8，AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。实验原理第2页,共28页，星期六，2024年，5月TEMED（加速剂）过硫酸铵硫酸根自由基（催化剂）Acr（双链）Acr（长链）+Bis(交联剂)PAG凝胶第3页,共28页，星期六，2024年，5月聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）浓缩效应（四个不连续性形成）分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）第4页,共28页，星期六，2024年，5月不连续体系由凝胶层、缓冲液离子成分、电位梯度、pH因素所组成。浓缩胶是大孔径，分离胶是小孔径；Cl-为快离子、甘氨酸根离子为慢离子、Tris为缓冲配对离子,Cl-PrGly-;浓缩胶缓冲液为pH6.7，分离胶缓冲液为pH8.9；电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液;电位梯度的差异是自动形成的，在快离子与慢离子之间形成电位梯度，由于Pr的有效迁移率介于快慢离子之间故也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成狭小的中间层；2种孔径的凝胶、3种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了，样品得到浓缩。第5页,共28页，星期六，2024年，5月样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子或慢离子：甘氨酸根当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：第6页,共28页，星期六，2024年，5月第7页,共28页，星期六，2024年，5月分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。电荷效应 电荷量不同，迁移率不同。第8页,共28页，星期六，2024年，5月实验仪器电泳装置稳压电源盘状电泳槽第9页,共28页，星期六，2024年，5月刻度吸量管玻璃管和橡胶帽第10页,共28页，星期六，2024年，5月培养皿微量移液器第11页,共28页，星期六，2024年，5月脱色摇床注射器和长针头第12页,共28页，星期六，2024年，5月实验试剂丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)Acr的重结晶Bis重结晶（注意固体Acr和Bis应贮存应贮存棕色瓶中，在干燥、低温和暗处保存，并注意避免超声波、γ-辐射和自然光的照射）第13页,共28页，星期六，2024年，5月TEMED-四甲基乙二胺，避免冰箱保存。过硫酸铵(不能潮解，否则不能用)染色液：用0.05NNaOH配制0.1％溴酚兰液洗脱液：7％醋酸其他试剂：见下表贮存液的配制。按表1配制各贮存液置冰箱中贮存，可放1—2月（但过硫酸铵液贮存冰箱不能超过一周）。第14页,共28页，星期六，2024年，5月第15页,共28页，星期六，2024年，5月实验步骤1、准备每人取电泳管1支，标好号码，并在距电泳管下端7cm和7.5cm处画横线做标记，在橡胶帽中滴1滴蔗糖溶液后，套在电泳管底端。第16页,共28页，星期六，2024年，5月2、制胶：取小烧杯2个，按表加液第17页,共28页，星期六，2024年，5月3.灌柱⑴按上述操作，把分离胶溶液混匀，用滴管将分离胶溶液加入到电泳管中，高至7cm处。然后在胶面上沿管壁缓缓注入0.5cm高的水层，切勿打乱凝胶液面，静置30min左右。⑵待分离胶成胶后，用细滤纸条吸干上层水分，灌浓缩胶至7.5cm处，再小心沿管壁加DDW高约0.5cm，静置15min左右。⑶该浓缩胶成胶后，弃去上层水分，拔出橡胶帽。第18页,共28页，星期六，2024年，5月4、样品液制备：血清:0.1ml40%蔗糖:0.1ml于一0.5mlEP管中混匀备用0.05%溴酚兰:0.1ml第19