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实验四PCR扩增技术
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一．实验目的及背景
l多聚酶链式反响(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年
代中期开展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，
可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，Ｐ
ＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领
域，引起了生物技术开展的一次革命，目前它在分子克隆，目的根底检
测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。
lＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件
下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反响，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物
和模板ＤＮＡ结合的特异性。反响分三步：①变性〔denaturation〕；②
退火〔annealing〕；③延伸〔extension〕，反响过程见图。
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l模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链；在５
５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分
别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ
聚合酶Taq酶催化下，在４种dNTP存在条件下
延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成
的ＤＮＡ为模板进行同样反响，如次往复循环30
次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，
３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。
成功的ＰＣＲ反响要求反响有很好的特异性和相
当的扩增效率。要达此目的ＰＣＲ反响要注意以
下问题：
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1.ＤＮＡ模板：反响中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左
右。且ＤＮＡ纯度较高，以增加反响特异性。
2.dNTP:反响体系中达100μM～200μM。
3.Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基,浓度在2.0mM左右，浓度
太低Taq酶活力降低；太高反响特异性降低。
4.引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱
基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之间；引物内部不能
有回文序列；引物３’端不能互补。
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5.Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，
在９５℃时３０分钟还有５０％活力。
6.变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。
7.复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引
物配对结合强弱而定，它是反响特异性的决定因素。
8.延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反响温度。
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二．实验试剂及仪器
l１０×buffer:500mMKCl
100mMTris-HCl(pH9.0)
0.1%明胶
1%TritonX-100
lMgCl2.5mM
2
l４×dNTP:1mM
l引物：actin上，actin下
l模板：20ng/μl
lTaq酶：5u/μl
lPCR仪，凝胶成像系统，电泳系统
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PCR仪
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