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实验七细胞固定与染色技术

一、实验原理

l1.

细胞固定的原理

培养的细胞离开培养环境后会发生复杂的改变，失去正常的成分，

结构被破坏，甚至坏死；而对细胞的观察和操作大多是不能直接在培

养环境中进行的，所以要对细胞进行固定，从而最大程度的保持细胞

生活时的状态。其主要原理就是用相应的固定液使细胞内的蛋白质变

性、硬化，保持生活时原有的成分和结构。

l2.

细胞染色的原理

细胞与周围背景没有明显的明暗差，所以通常观察到的细胞都是透明

的，细胞的内部构造和成分都隐藏在背景当中，借助物理或化学的方

法对细胞进行染色能够增强观察对象与背景的区别，帮助我们进行定

性或定量观察。

二、固定

目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有：

1．

物理固定：如血膜空气快速枯燥、冷冻枯燥或直接冷冻切片。

2．

化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细

胞结构中的某些物质加以固定保存。

不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活性的影响、保存结构的细腻度均不

相同。因此，要根据实验要求和组化反响，选择最正确的固定方法和固定

剂。如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。

细胞染色技术

〔一〕、染料〔天然染料和人工染料〕：

将生物组织细胞和病原体染色，在显微镜下观察结构。

发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被染组织亲合。

1.碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核的染料。如亚甲蓝、天青。

2.酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，

能结合细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分等。

3.复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料

〔二〕、细胞染色原理：一般以它们的物理现象和/或化学现象为依据

1.物理作用：毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等

2.化学作用：

a.染料的化学成分：助色基团的存在，碱性染料在溶媒中为阳离子型，易与组

织和细胞内带负电荷的酸性物质结合；而酸性染料在溶媒中为阴离子型，与带

正电荷的碱性物质结合。

b.蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同数量的氨基〔-NH2〕和羧基

〔-COOH〕，同时还有其他活性基团。在游离状态时，-NH2获得一个H+变

成带正电的-NH3+，而-COOH失去一个H+变成带负电的-COO-。分别与不同

染料结合。

c.周围环境的酸碱度：如环境pH＜pI〔pI为等电点〕，那么蛋白质带正电，结

合酸性染料；反之，pH＞pI，那么结合碱性染料。

〔三〕、细胞染色法的类型

1.普通染色法：经物理和/或化学作用的吸附、结合

2.荧光染色法：荧光染料，荧光显微镜

3.细胞活体染色法：活体染料如灿烂甲酚蓝等

4.

隆抗体技术、酶标记技术〕

瑞氏染色法

1．瑞氏染料

酸性染料伊红〔eosin,E-〕

碱性染料亚甲蓝〔methyleneblue,M+；又名美蓝〕组成复合染料。

甲醇：溶解美蓝和伊红ME；固定细胞的形态；提高对染料的吸附作用。

注意：pH值的影响

细胞各种成分多属蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定。

在偏酸时正电荷〔H＋〕增多，易与伊红结合，染色偏红。

在偏碱时负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。

染料贮存时间愈久，染色效果愈好。

染液贮存，必须加塞，以防止甲醇挥发和被氧化成甲酸。

参加甘油,防止甲醇挥发，染色清晰。

〔二〕、试剂

1.Wright染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml

甲醇：有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态，并使蛋白质沉淀为颗粒状、

网状等结构，增加细胞与染料接触外表积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。

2.磷酸盐缓冲液〔PBS〕：磷酸二氢钾〔无水〕0.3g，磷酸氢二钠〔无水〕0.2g,