鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程.doc

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鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程

范围

本文件规定了鳜鱼传染性脾肾坏死病的诊断、综合防控和记录。

本文件适用于鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测，鳜鱼传染性脾肾坏死病的诊断和综合防控。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB11607渔业水质标准

SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范

3术语和定义

本文件无术语和定义。

4诊断

4.1现场调查

水质情况包括水源、水色、水温、透明度、pH、亚硝酸盐、氨氮、溶解氧、硬度等；养殖情况包括养殖密度、苗种来源、饵料鱼来源等。

4.2临床诊断

患病鱼表现为沿池边漫游而死，鳃盖、口腔周围、下颌、胸鳍、腹鳍充血，鳃发白，解剖后肝脏呈现白色或有出血点，肾脏和脾脏肿大或有明显的出血点，部分胆囊肿大，部分幽门盲囊出血（图1）。

4.3检测方法

4.3.1试剂材料

无水乙醇（分析纯）；

三氯甲烷（分析纯）；

异戊醇（分析纯）；

1mmol/LEDTA，pH8.0；

1%SDS；

ddH2O；

10mmol/LTris-HCl，pH8.0，4℃保存；

Tris饱和酚，4℃保存；

8U/μLBstDNA聚合酶，-20℃保存；

10mmol/LdNTPs混合物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L），-20℃保存；

10000×SYBRGreenI，-20℃保存；

25mmol/LMgCl2，-20℃保存；

10×Thermopolbuffer，-20℃保存；

甜菜碱，-20℃保存；

10×PCRBuffer，-20℃保存；

5U/μLTaqDNAPolymerase，-20℃保存；

20mg/mL蛋白酶K，-20℃保存；

LAMP检测引物序列：

F3：5′-AACCACCAGGCAGAAATGG-3′

B3：5′-ATCCGAGGCGACGTCATC-3′

FIP：5′-TAAAGCCAAAGCCCACATCGGCGAAGACATGGTGCGCTACT-3′

BIP：5′-AAGCAAGTGCACAGCACCCGTCAAGCCTCGCACAGAGG-3′

巢氏PCR检测引物序列：

MCP-F1：5′-ATGTCTGCAATCTCAGGT-3′

MCP-R1：5′-TTACAGGATAGGGAAGCCTG-3′

MCP-F2：5′-GCGTTTGATGCGATGGAGAC-3′

MCP-R2：5′-ACGGCAGAGACACGGTAGGC-3′

4.3.2仪器设备

灭菌锅；

水浴锅；

PCR仪；

紫外分光光度计；

电泳仪；

电泳槽；

凝胶成像系统；

离心机。

4.3.3采样

采集样品的数量参见SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范。鳜鱼体表用75%酒精消毒后解剖剪解剖，无菌操作，剪取小块肾脏、脾脏、肝脏，匀浆后用于DNA提取。

4.3.4检测样本模板制备

利用酚-氯仿法抽提混合组织DNA。每个样品取组织100mg~200mg，匀浆后置于1.5mL微量离心管，加入含蛋白酶K的裂解液（10mmol/LTris-HCl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0；1%SDS），60℃消化1h~3h。

用Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）混合液提取、纯化DNA，-20℃冷冻的无水乙醇沉淀DNA，自然干燥，溶于灭菌ddH2O。紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，X脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。DNA样品置于-20℃冰箱保存备用。

4.3.5环介导等温扩增（LAMP）检测方法

4.3.5.1LAMP扩增

按表1加入各项试剂进行LAMP扩增，同时以ddH2O为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照，LAMP的反应条件：65℃保持60min，80℃终止反应10min。

表1LAMP反应体系（25μL）

试剂

体积（μL）

DNA模板

2

内引物（FIP、BIP）

各1

外引物（F3、B3）

各1

dNTPs（10mmol/L）

2.5

10×Thermopolbuffer

2.5

甜菜碱（5mol/L）

4

MgCl2（25mmol/L）

2

BstDNA酶（8000U）

1

ddH2O

补足至25

4.3.5.2LAMP