dna提取个步骤作用原理.pdfVIP

质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都

是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持

续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，

随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒

DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质

粒DNA。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH

和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能

够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮

状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，

氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等

方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，

RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已

可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子

生物学实验室中常用。

一、试剂准备

1.溶液Ⅰ:50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0）。1M

Tris-HCl!--[if!supportAnnotations]--[t1]!--[endif]--(pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH

8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10lbf/in2高压灭菌15min，贮存

于4℃。

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl

溶液。50mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所

以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属

离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微

生物生长。在溶液I中加入高达10mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所

有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，

只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶

解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒

呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。

这是用新鲜的0.4N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释

制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH

是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在

瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构

的相变化所导致。用了不新鲜的0.4NNaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌

（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提

得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以

为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA

变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS

呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不

要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢