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酶的筛选与鉴定

蛋白酶是工业酶中应用最广最多的一类酶，约占酶总量的

60%。如在制革工业中，利用蛋白酶制剂对各工序中蛋白质进行

处理。此外，在食品、饲料和饵料等生产过程中，蛋白酶被广泛

作为各种添加剂使用。比如，在鱼类养殖中，从鱼体消化道筛选

出的高产蛋白酶菌株产生的蛋白酶制成的酶制剂可作为饵料（尤

其是开口饵料）的添加剂使用，从而弥补人工育苗早期鱼苗因消

化道发育尚不完全而导致的酶分泌量的不足，降低育苗过程中鱼

类的死亡率，提高其生存率，进而节约育苗成本。因此，在用开

口饵料进行苗种培育时，必须添加益生菌或酶制剂以弥补鱼苗

消化酶分泌不足的状况。益生菌是一类具有巨大实用价值的生物

工程产品，它是由从宿主体内、水体等分离出的菌群成分制成的

活菌制剂，再通过适当途径作用于养殖动物。目前，国内外报道

的益生菌主要有乳酸菌（包括乳杆菌和肉杆菌），芽胞杆菌和假

单胞菌，其中应用最广泛的是能产生蛋白酶的芽胞菌。

本实验从大菱鲆的肠道中分离出一株能产蛋白酶的菌株，通

过对该菌株进行形态学，生理生化和16SrDNA序列分析及其系

统发育分析以期更好地了解该菌株和利用该菌株。形态学的鉴定

主要是对菌株和菌落的观察，在本实验中利用革兰氏染色和芽胞

染色对菌株进行初步的鉴定。在形态学的鉴定基础上该菌株的生

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理生化鉴定为接触酶，氧化酶和能否利用一些葡萄糖类物质。16S

rDNA序列分析及其系统发育分析则能更精确地分析出该菌株的

属和科。

【关键词】蛋白酶筛选鉴定

本实验中采用选择性培养和富集培养两种不同的培养方法

从大菱鲆肠道中分离筛选出一株水解圈较大的产蛋白酶菌株，并

将这株菌株命名为B5。将B5菌株接种到海水琼脂培养上培养

24h使菌株活化，之后挑取单菌落进行涂片和革兰氏染色，革兰

氏染色的过程为：①取无油迹的干净载波片，滴上一滴无菌蒸馏

水，用接种环挑取少许菌苔，于水滴边缘轻轻涂几下。②自然风

干，或在火焰上通过几次，固定涂片。③滴加结晶紫液，染一分

钟。用水冲净结晶紫液。④滴加碘液，覆盖约1min。用水冲去碘

液，将片上的水甩干。⑤滴加95%乙醇液脱色，并立即用水冲净

乙醇。⑥番红液染1-2min。用水洗净，风干，用显微镜油镜观察

涂片。菌体红色为革兰氏染色阴性，蓝紫色为革兰氏染色阳性。

将B5菌株进行芽胞染色，芽胞染色的过程是：（1）加孔雀绿染

液2—3滴于已涂上B5菌株的玻片上，然后加热染色15min：

（2）水冲洗，至到流出的水无绿色为止；（3）用0.5%沙黄液复

染2min，弃去多余的染液，吸水纸吸干镜检（此步骤不用水冲

洗）。利用上述的初步鉴定结果参照《常见细菌系统鉴定手册》

和《伯杰氏细菌鉴定手册》（第9版）和常规生理生化鉴定对B5

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菌株进行以下生理生化分析：氧化酶和接触酶的分析，是否产

H2S，甘露醇，葡萄糖和尿素利用。氧化酶试验的过程为：取白

色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者

呈现粉红色，并逐渐加深；再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半

分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。接触酶试验过程：

将24h培养的斜面菌种，以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有3%

过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。产

H2S试验的过程：以无菌操作将B5菌穿刺接种至培养基中，并

将接种后的培养基放在37℃的恒温培养箱中培养24