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转染步骤及经验（精华）

转染步骤及经验（精华）

一、基础理论

转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介

导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷

酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的

技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较

多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染

效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率

最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的

准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很

难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出

的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需

要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细

胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。

二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）

（1）细胞培养：

取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37C5%CO2培养箱中

培养至70%?90%汇合。（不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件

进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞）。

（2）转染液制备：

在EP管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量）A液：

用不含血清培养基稀释1-10卩gDNA终量100yL,B液：用不含血

清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100uL

轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现

微浊现象，但并不妨碍转染。

（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL

不含血清及PS的培养液。

（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻

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摇匀，37C温箱置6?8小时，吸除

无血清转染液，换入正常培养液继续培养。

三、转染注意事项

1.血清

A.DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影

响复合物的形成。

B?一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培

养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，

转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。

C.对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无

血清培养基OPTI-MEMI培养基，

或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，

建议使用LIPOFECTAMINE2000。无血清培养基OPTI-MEM

（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意

洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动

培养板让液体滚动在细胞表面。

如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影

响就更大了，死亡细胞会增多。

2?抗生素（PS）

抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这

些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的

通透性，使