药品生物技术《酵母RNA 的提取》.pdfVIP

实验三酵母RNA的提取、测定

及组成成分的分析

Ⅰ酵母RNA的提取——浓盐法

【目的和要求】

了解用浓盐法提纯RNA的基本原理和方法

【基本原理】

核酸是一类不稳定的生物大分子，在制备过程中很容易发生降解。因此，要

使制得的核酸尽可能保持其在生物体内的天然状态，制备核酸必须采取温和的条

件，例如避免过酸碱，避免剧烈的搅拌，防止核酸降解酶类的作用。

由于RNA种类较多，所以制备方法也各异。工业上制备RNA一般选用成本较

低、适宜于大规模操作的稀碱法和浓盐法。稀碱法是用1%NaOH溶液，将细胞壁

溶解，用酸中和，升高温度使蛋白质变性，将蛋白质与核酸分离，然后除去菌体，

将2gL三角瓶内。加10%Nacl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴中提取半小

时。

2．分离

将上述提取液取出，用自来水冷却，分装在离心管内，以3500r/min离心

10min，使提取液与菌体残渣等分离。

3．沉淀RNA

将离心得到的上清液倾于50mL烧杯内，并置于放有冰块250mL烧杯中冷却。

待溶液冷至10℃以下时，在搅拌下小心地用6mol/LHCL溶液调节in，使沉淀充

分，颗粒变大。

1．冼涤

上述悬浮液3000r/min离心5min，得到RNA沉淀。小心弃去上清液，加入

3mLL碳酸氢钠溶液溶解沉淀（必要时用玻捧搅拌沉淀物以助溶解，如有不溶物

则为杂质）。在4000r/min离心1min。取上清液于另一离心管中，加入2倍体积

的95%乙醇，混匀。重新沉淀RNA，3000r/min离心5min，即得湿RNA粗制品。

（如果要干燥的RNA制品，可在真空干燥箱内烘干。如果要得到精制可进行多次沉淀。）

RNA粗制品可供定量测定实验用。

【材料与试剂】

1．实验试剂、材料：

（1）鲜酵母

（2）10％NaCI（化学纯）

（3）6mol/LHCI溶液

（4）95%乙醇（化学纯）

（5）mol/L碳酸氢钠

（6）精密试纸：（7）冰块

【实验器材】

①量筒（25mL）②三角瓶（50mL）③烧杯（250mL、50mL）

④滴管及玻棒⑤温度计（100℃）⑥离心机

⑦恒温水浴箱（100℃）⑧台秤⑨试管木夹

⑩精密

波长处。

核酸的消光系数（或吸收系统），通常以∈（ρ）或E来表示，即每升含有一

ρ

克核酸磷溶液在260nm波长处的消光（即光密度，或称为光吸收）。核酸的消光

系数不是一个常数，而依赖于材料的前处理、溶液的（长下，每毫升含1微克

DNA溶液的消光值（即）为。故测定未知浓度的RNA（或DNA）溶液的值，即可

计算出其中核酸的含量。该法操作简便，迅速。对于含有微量蛋白质和核苷酸等

吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。若样品内混杂有大量的上述吸收紫

外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。

由于降解或水解作用，核酸的消光系数可以增高约40％，此现象称为增色效

应。在大分子的核酸中，氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为。因此，

核酸的消光低于构成它的核苷酸的消光。该象称为减色效应。

【操作方法】

一、核酸样品纯度的测定

1．准确称取待测的核酸样品0.5克，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊

状，再加适量的水，用5～6％氨水调到l。

2．取两支离心管，甲管内加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水；乙管内加入2ml

样品溶液和2ml沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。混匀，在冰浴（或

冰箱）中放置30min，离心10min。从甲、乙两管中分别吸取上清