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反向液相色谱的工作原理--第1页

谁能告诉我一下反向液相色谱的工作原理吗？它与正向的有什么区别吗？

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、

离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸

附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧

化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，

离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固

定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一

个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体

表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的

固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少

采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的

疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以

调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及

氨基酸类等）。

反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、

乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性

和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应

用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或

易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需

要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，

太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法反相色谱法

固定相极性高～中中～低

流动相极性低～中中～高

组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出

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从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合

固定相）。

3．离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，

在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。

被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被

测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分

离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH

值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度

高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。

离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

4．离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是