基因组DNA提取与PCR技术课件.pptVIP

精选ppt课件2021*二、PCR引物设计PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。其效率和特异性取决于两个方面,一是引物与模板的特异结合,二是聚合酶对引物的有效延伸。精选ppt课件2021*1、引物长度一般为15~30个核苷酸。2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54°C3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。4.两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。（一）PCR引物设计原则精选ppt课件2021*5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6.引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。精选ppt课件2021*7、引物的5′端可以修饰,如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素,荧光物质,地高辛标记,加入其它短序列包括起始密码子,终止密码子等。在PCR的起始反应中,引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中,这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去,所以这种引物参与的PCR反应产物,既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。精选ppt课件2021*（二）引物设计的方法现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，在线引物设计的网站有:http://cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3–www.cgi–www.cgi;/cgi-bin/SGD/web-primer;http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi;/~urolab/methprimer/index1.html;/rawprimer.html精选ppt课件2021*10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul标准的PCR反应体系精选ppt课件2021*PCR反应条件的控制

PCR反应成分1.PCR反应的缓冲液:10-50mmol/LTris-Cl缓冲液，72℃时pH7.2,调节反应体系的pH值，使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。精选ppt课件2021*TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低,会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度,从而影响扩增片段的产率。在PCR反应中,Mg2+的总量应比dNTPs的浓度高。其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度,从而影响TaqDNA聚合酶的活性。常用1.5mmol/L。2.镁离子浓度:1.5mmol/L精选ppt课件2021*dNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值调至7.0-7.5,分装小管,于-20℃存放,过多冻融会使dNTP产生降解。在PCR反应中,dNTPs浓度在20-200μmol/L,dNTP浓度过高可加快反应速度,同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之,低浓度的dNTP会导致反应速度的下降,但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等摩尔数浓度配制,以减少错配误差和提高使用效率。3.底物浓度:20-200μmol/L精选ppt课件2021*在PCR反应