DB13_T 1767-2013 苹果品种 DNA 指纹鉴定.docx

ICS?65.020.20

B?05

DB13

河 北 省 地 方 标 准

DB?13/T?1767—2013

苹果品种?DNA?指纹鉴定

2013?-?09?-?05?发布 2013?-?09?-?30?实施

河北省质量技术监督局 发?布

DB13/T?1767—2013

前 言

本标准按照GB/T?1.1—2009给出的规则起草。

本标准由河北省林业厅提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：刘兴菊、杨敏生、梁海永、张军、左立辉、李雪雁、姚伟明、杨立华、韩志校

魏姗姗、甄红伟、王瑞霞。

I

DB13/T?1767—2013

苹果品种?DNA?指纹鉴定

1??范围

本标准规定了苹果品种DNA指纹鉴定的方法及判定标准。

本标准适用于苹果品种鉴定及河北省苹果品种DNA指纹库的建立。

2??原理

不同苹果品种由于遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可经过

PCR扩增、电泳分离、显色程序绘制的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进行鉴定。从苹果幼苗、

叶片等组织中提取总DNA，利用SSR引物对位于不同染色体上的SSR位点进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR

扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（或通过DNA分析仪、测序仪进行分离），并通过染色显示DNA

指纹谱带类型。

3??仪器设备及试剂

苹果品种DNA指纹鉴定所需仪器设备及试剂名单见附录A。

4??溶液配制

苹果品种DNA指纹鉴定相关溶液配制方法见附录B。

5??鉴定方法

5.1 样品准备

5.1.1 取样量

每份送检样品至少检测3个个体，每个个体至少1g，对一致性差的样品应至少检测5个个体。

5.1.2 品种比较方式

a)??成对品种的比较

送检样品提供两份，一份为待检品种，一份为对照品种。将待检品种与对照品种直接进行成对比

较。杂交后代需提供母本与父本的样品。

b)??品种与?DNA?指纹库入库品种的比较

送检样品可提供一份。将待检样品与?DNA?指纹库所有入库品种的指纹进行比较，筛选出指纹最相

似或相同的品种作为待检品种的近似品种，然后将待检品种与近似品种直接进行成对比较。

5.2 DNA?提取

1

反应组分

原浓度

终浓度

反应体积?μL

ddH2O

13.35

10×buffer

10×

1×

2

MgCl2

25mmol/L

2.5mmol/L

2

dNTP

2.5mmol/L

0.15mmol/L

1.2

Taq?酶

5U/μL

1U

0.2

引物

20μmol/L

0.25μmol/L

0.25

DNA

30~50ng/μL

1.5~2.5?ng/μL

1

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5.2.1 宜采用改良的?CTAB?法。取?200mg?干净叶片置入?1.5mL?离心管中，加入?500μLDNA?提取液研磨碎，

并加?1mL?洗涤液及?30μLβ-巯基乙醇，充分摇匀后置冰上?5min，于?4℃，12000?g?离心?8min?后，洗涤

一次，弃上清，再加?700μL?预热的?CTAB?缓冲液,充分混匀后，于?65℃水浴?60min，其间颠倒几次。然

后于室温冷却?4?min～5min，取上清,加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),混匀抽提，室温静置?5min，

于室温?12000?g?离心?8min。上清液移于一新的?1.5mL?离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，充

分混匀后室温静置?5min，室温?12000g?离心?8min，取上清，重复加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，

取上清加入等体积氯仿抽提一次，取上清液，加入?2?倍体积的无水乙醇(-20℃)，轻轻混匀后在-20℃沉

淀?30?分钟以上，12000?g?离心?10min，将所得沉淀风干后溶于?100μL?水中，置?4℃冰箱备用。

5.2.2 其它保证?DNA?质量的方法也可采用，应用前需要通过微量紫外分光光度计进行?DNA?质量与浓度

检测。

5.3 PCR?扩增

5.3.1 SSR?扩增

基本核心引物名单见附录C。

5.3.2 反应体系

反应液体积为20μL，组分配制应符合表1的规定（或按比例减少至10μL）。

表1 PCR?反应体系

5.3.3 反应程序

5.3.3 反应程序

存。

5.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

5.4.1 清洗玻璃板

用自来水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上

涂上0.5?mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5?mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互

相污染。

5.4.2 组装电泳板

待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。

2

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5.4.3 灌胶

在100?mL?4?.5%PAGE胶中加入TEMED和25%