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感受态细胞制备及重组转化--第1页

第一节概述

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人

工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完

成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱

导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传

性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验

技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制

性内切酶和甲基化酶的突变体，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳

定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl，RbCl(KCl)等

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化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源

DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通

过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化

后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源

DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)

法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl法简便易行，且其

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转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加

入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl法为使用更广泛。

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为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：

1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－

70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长

密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α

菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所

不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

2.质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA

(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外

源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl

的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体

积的5％。

3.试剂的质量：所用的试剂，如CaCl等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用

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超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，

如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且

注意防止被其它试剂、