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马铃薯晚疫病菌PCR检测方法

1范围

本文件规定了马铃薯晚疫病菌PCR检测方法。

本文件适用于马铃薯植株、块茎中晚疫病菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

马铃薯晚疫病potatolateblight

由致病疫霉(Phytophthorainfestans(Montagne)deBary)侵染引起马铃薯病害。可侵染马铃薯的叶片、茎杆以及块茎等。发病初期病斑多在叶尖和叶缘处形成水浸状褪绿斑，后扩大为圆形暗绿色斑，病斑边缘界限不明显。在空气湿度大时，病斑可扩及叶的大半以及全叶，病斑边缘有一环白色稀疏的霉轮，茎部受害，可形成长短不一的褐色斑。块茎发病，初为褐色或紫褐色不规则的病斑，稍凹陷，后期导致薯肉不同深度的褐色坏死。潮湿条件下，茎秆和块茎发病部位能够形成白色稀疏的霉层。

4原理

本文件采用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）方法检测马铃薯晚疫病菌。其原理是：以马铃薯晚疫病菌ITS序列区设计特异性引物，以基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段，从而达到鉴定马铃薯晚疫病菌的目的。

5试剂与仪器

5.1试剂

5.1.1以下所有试剂，除另有规定外，均使用分析纯试剂；水为符合GB/T6682中规定的一级水。

5.1.2植物基因组提取试剂盒、2×TaqPCRMasterMix、无水乙醇、50×TAE电泳缓冲液、溴化乙锭、DNAMarker、6×DNALoadingBuffer等均从试剂公司购买。

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5.2溶液配制

5.2.1溴化乙锭溶液（10mg/mL）

称取溴化乙锭100mg，加水溶解，定容至10mL。

5.2.21×TAE电泳缓冲液

量取50×TAE电泳缓冲液20mL，加水定容至1L。

5.2.31.0%琼脂糖凝胶

称取1.0g琼脂糖，加入100mL的1×TAE电泳缓冲液，微波炉加热至琼脂糖融化，待溶液冷却至50℃左右时，加入5μL溴化乙锭溶液，摇匀，倒入制胶板中均匀铺板，凝固后取下梳子，备用。

5.3仪器

PCR仪、台式高速离心机（离心力1180g～12470g）、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、移液器、高压蒸汽灭菌锅、4℃冰箱、普通天平（感量0.01g）。

6操作步骤

6.1对照的设立

检测体系以马铃薯晚疫病菌的DNA作为阳性对照，以不添加DNA模板的反应体系作为阴性对照。

6.2取样

一块地取发病马铃薯植株或块茎组织，将样品保存于4℃冰箱中，DNA提取时取马铃薯叶片或块茎组织0.2g，样品需现用现取。

6.3马铃薯组织样品DNA提取

将样品置于灭过菌的研钵中，加液氮研磨成粉末，转至1.5mL离心管，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取。

6.4PCR扩增

6.4.1PCR扩增引物

在ITS序列区设计引物，引物序列如下：

上游引物：5’-TGGGCGAGCCCTATCAAAA-3’。

下游引物：5’-CGATTCAAATGCCAAGCTAA-3’。

扩增片段大小为613bp。

用超纯水将上、下游引物分别配制成工作浓度为10ng/μL的溶液。

6.4.2PCR反应体系

马铃薯晚疫病菌PCR扩增反应体系如表1所示，按照以下顺序加入相应试剂到PCR管中，混匀并离心10s，使混合液都沉降到PCR管底。详见表1。

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表1PCR扩增反应体系

PCR反应物

加入PCR反应体系的体积

uL

ddH2O

18.0

2×TaqPCRMasterMix

4.0

上游引物（10ng/uL）

1.0

下游引物（10ng/uL）

1.0

模板DNA

1.0

总体积

25.0

6.4.3PCR反应程序

第1步：95℃,5min。

第2步：94℃,40s；52℃,40s；72℃,40s，循环36次。

第3步：72℃,10min。

PCR产物置于4℃冰箱保存备用。

7琼脂糖凝胶电泳

使用1.0%的琼脂糖凝胶，取5μLPCR扩增产物，加到1μL6×DNALoadingBuffer中混匀、上样，用DNAMa