细胞与分子生物学：第三章 细胞生物学实验技术.ppt

2、负染技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。NegativeStainedActin3、冰冻蚀刻freeze-etching亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。４、电镜三维重构技术对样品在不同的倾角拍照，得到图片经处理后而展现的电子密度图。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。５、扫描电镜技术20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。Scanningelectronmicroscope（SEM）工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。扫描电子显微镜原理人类精子3、扫描隧道显微镜

scanningtunnelingmicroscope，原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。扫描隧道显微镜原理1、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。第二节细胞组分的分析方法超速离心技术：用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation2、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法１、DNA经1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。２、四氧化锇与不饱和的脂肪酸反应呈黑色，证明脂肪滴的存在，苏丹Ⅲ使脂滴呈深红３、蛋白质定性：米伦反应，重氮反应3、特异蛋白抗原的定位与定性3.1免疫荧光技术将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。常用的标记物有荧光素和酶。免疫荧光法（immunofluorescenttechnique）：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。间接法原理示意图补体结合法原理示意图3.2免疫电镜技术又称为免疫细胞化学技术是在免疫组织化学技术的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主