酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序.pdfVIP

酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序--第1页

酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序

第一节间接ELISA试验

一用可溶性抗原的ELISA：

1、纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml；

2、以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；

3、置4（度）过夜或37（度）吸附3h；

4、PBST洗三次；

5、每孔200ulPBS/NCS4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；

6、PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保

存备用）

7、每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。若杂交

瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清；

8、37（度）孵育2h

9、PBST洗5次，每次5min

10、每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP

标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体；

11、37（度）孵育2h

12、PBST洗5次，每次数5分钟；

13、每孔加OPD或TMBS底物100ul

14、37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；

15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD

底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；

酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序--第1页

酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序--第2页

16结果判定：

（1）P/N≥2.1为阳性

(2)P≥N+3SD为阳性

成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定

和鸡白痢检疫等。

二、用全菌抗原的ELISA法

（一）GA法

1、新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌

浓度至1X10（6）个/ml。

注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭

活诊断菌液；

2、酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1MNaHCO4

95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时

3、蒸馏水洗5次;

4、加细菌悬浮液,50ul/孔;

5、37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h)

6、加PBS/NCS220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封

闭；

7、PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；

8、以下步骤同一。

（二）MA法

1、细菌悬液（1X10（6））50ul/孔；

酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序--第2页

酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序--第3页

2、室温或37（度）干燥吸附；用甲醇（MA）固定；室温10分

钟；

3、加PBS/NCS封闭，37（度）3小时或4（度）过夜；

4、PBST洗5次（于—20度或4度保存备用）；

5、以下步骤同一

成功范例：H单抗检测等。

三、用全细胞抗原的ELISA

1、按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染的细

胞，进行细胞计数，用PBS制成适