马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程.docx

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标准名称

1范围

本标准规定了马铃薯晚疫病菌采集分离纯化、生理小种室内鉴定的培养基的制备、鉴别寄主的培育、

接种鉴定、病情调查、生理小种的鉴定、供试材料的高温灭活处理。

本标准适用于马铃薯晚疫病菌的生理小种鉴定。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.1马铃薯晚疫病

指由疫霉属致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.)DeBary]侵染马铃薯所引起的一种毁灭性

病害。

2.2接种体

用于人工接种鉴定所需的马铃薯晚疫病菌[Phytophthorainfestans]的孢子囊悬浮液。

2.3鉴别寄主

一套含有主效抗性基因R1～R11和已知无R基因的感病材料（r）的马铃薯品种。

2.4生理小种

病原物种内或专化型内在形态上无差异，但在寄主植物的品种上具有显著致病性差异的类群。

2.5人工接种

在适宜的条件下，通过人工操作将一定浓度马铃薯晚疫病菌的孢子囊溶液接种到马铃薯植株的适当

部位使之发病的过程。

2.6离体叶片接种法

使接种体与离体叶片接触以促使组织发病的一种鉴定方法。

3接种体制备

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3.1病样的采集

在晚疫病发生较为严重的田块，选择具有典型症状的病叶随机采取5片，记录采集时间和地点，放入冰壶内1天内带回实验室进行分离，分离物经形态学鉴定（附录A）为致病疫霉后，再进行分离物纯化

和生理小种鉴定。

3.2培养基的制备

3.2.1黑麦培养基

称取50g～60g黑麦，在蒸馏水中浸泡24h～36h，在121℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌30min，取出用双层纱布过滤去渣，上清液补足水至1000mL，加入琼脂20g，用玻棒搅匀，经三角瓶分装好后在121℃下高压

蒸汽灭菌20min。

3.2.2白云豆培养基

称取白云豆粉60g，用50℃~60℃水浴1h～2h，双层纱布过滤后加入V8蔬菜汁100mL，琼脂粉20g，

CaCO31.4g,加入蒸馏水定容至1000mL后在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

3.2.3选择性培养基

在上述2种培养基中分别加入利福平20mg·L-1，氨苄青霉素200mg·L-1，70%五氯硝基苯100mg·L-1。

3.2.4MS培养基

硝酸钾1900mg，硝酸铵1650mg，磷酸二氢钾170mg，硫酸镁370mg，氯化钙440mg，碘化钾0.83mg，硼酸6.2mg，硫酸镁22.3mg，硫酸锌8.6mg，钼酸钠0.25mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，乙二胺四乙酸二钠37.25mg，硫酸亚铁27.85mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，盐酸硫胺素0.1mg，盐酸吡

哆醇0.5mg，烟酸0.5mg，蔗糖30000mg，琼脂7000mg，蒸馏水1000mL，PH调至5.5。

3.3病原物的分离与纯化

3.3.1叶片保湿分离纯化法

将具有典型症状的叶片在自来水下冲洗干净，然后用蒸馏水冲洗1遍，用滤纸吸取叶片表层的水分。用灭菌过的剪刀在病健交界处剪取3cm×3cm叶块，背面朝上置于0.5%～0.8%水琼脂培养基上保湿培养24h，然后用灭菌挑针挑取小块菌丝块，接种在选择性黑麦培养基上，把培养基放在16℃~18℃的生化培养箱中黑暗培养3d～4d后，在从菌落边缘挑取菌丝置于选择性黑麦培养基上，并放入16℃~18℃的生

化培养箱中黑暗培养纯化，备用。

3.3.2块茎夹叶分离纯化法

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将健康的马铃薯块茎经表明消毒（将马铃薯表面浸入70%-75%的乙醇溶液后取出，用5.%-20%NaClO溶液表面消毒5min-10min,用无菌水冲洗3遍）后，用消毒刀切成0.5cm厚左右的薄片，置于灭菌培养皿中，然后在病叶的病健交界处剪取约0.5cm2的叶片组织，置于已消毒的两薯片之间，在15℃~18℃黑暗条件下培养，3d～5d后在薯片上即可见白色霉层，用灭菌挑针在薯片上挑取晚疫病菌菌丝，放在选择性白云豆培养基上，每皿接种3点，将培养皿置于生化培养箱中18℃黑暗培养7d～10d后，在菌落边缘挑取

少量菌丝转移到选择性白云豆培养基上，在18℃黑暗条件下培养纯化，备用。

3.4孢子囊悬浮液的制备

菌株在培养基上纯化培养7d后，将其转移至经表面消毒的新鲜薯片上，按3.3.2方法培养使其产生孢子囊，5d～7d后薯片表面即可见大量白色霉层，用玻片刮下菌体放入装有3mL灭菌水的离心管中，充分振荡配成孢子囊悬浮液，用双层纱布过滤，血球计数器计数，将浓度调制成每毫升含2000～3000个孢

子囊，将悬浮液置于4℃冰箱中2h～3h诱导游动孢子的释放，备用