重组导入受体细胞 (2).ppt

**0.24-1.9mol/lcacl7.69-76.9mmol/l亚精胺25%peg4000**7.花粉管通道法（3）特点：直接得到转化种子，不经过组培，减少了基因型的影响；操作简单经济，无需昂贵仪器和化学药品，可直接在大田操作；大量快捷，性状稳定，转化率高；可获得1×10-2~1×10-1的高遗传转化率。不仅可以导入供体的总DNA，而且可导入含目的基因的质粒，甚至可将化学诱变剂导入胚囊。缺点：工作时间受自然花期限制，田间操作受环境影响大，基因组以随机方式结合，要求工作人员经济性要强，工作效率较低。第63页,共89页，星期六，2024年，5月我国科学家周光宇在1983年首次在“MethodsinEn-zymology”报道的研究成果。现该技术主要在蔬菜育种上应用。（白菜、茄子、黄瓜、番茄、辣椒等操作步骤1.外源DNA的制备2.分析受体植物的受精过程及时间，确定导入外源DNA的时间方法（3种）柱头涂抹法柱头切除法花粉粒吸入法3.后代材料处理第64页,共89页，星期六，2024年，5月9.激光微束穿孔转化法早在1984年Tao等首先利用激光微束对动物细胞进行DNA转化试验、此庸Web等利用激光微束技术对原生质体、花粉以及活细胞内的叶绿体进行外源DNA导入获得成功，并用荧光标记的大肠杆菌pBR322质粒DNA在转化细胞中得到检测。（1）原理：利用直径很小、能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理。在荧光显微镜下找适合的细胞，然后用激光代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔外于细胞周围的外源DNA分子随之进入受体细胞。第65页,共89页，星期六，2024年，5月9.激光微束穿孔转化法（2）特点：操作简便快捷，转化效率高10-3-10-4，无宿主限制，但需要贵重仪器，技术条件要求高，稳定性和安全性不如电穿孔法和基因枪法。（3）适用范围：动植物细胞、组织、器官及线粒体、叶绿体。第66页,共89页，星期六，2024年，5月过程1）DNA的提取2)受体植物样品制备：将欲照射的植物细胞或组织用高渗缓冲液浸泡数分钟，不同作物不同外植体所用高渗液不同，浸泡时间也不同。3)转导细胞悬浮液准备：激光照射前洗去高渗液，加新鲜培养液。吸取0.5mI细胞悬浮液，加50ul质粒DNA或植物外源DNA(浓度5ug／ml)．一起注入激光微束系统的Rose小室。第67页,共89页，星期六，2024年，5月4)激光微束照射：激光微束显微照射装置如为Nd—YAG四集倍频脉冲激光冠微照射系统、即输出波长技需要选择，脉宽10-15ns。激光束引入一台相差显微镜，用40ⅹ物镜聚焦Y于欲照射的细胞。光斑直径为1.3nm。照射时移动载物台，使激光脉冲在植物细胞团上进行扫描照射，照射时间每个佯品60分钟，约打7000个脉冲。5)培养：激光照射后，将样品用新鲜的培养液冲洗1-2次，然后接种在装有液体培养基的小培养皿中，25度条件下悬浮培养2-3天或固体培养。第68页,共89页，星期六，2024年，5月第69页,共89页，星期六，2024年，5月10.病毒颗粒转导法（1）原理：用病毒(噬菌体)DNA(或RT-DNA)构建的克隆载体或携带目的基因的克隆体，在体外包装成病毒(噬菌体)颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组DNA进入受体细胞，将此过程称为病毒(噬菌体)颗粒转导法。（2）适用范围：主要用于构建基因文库和物的转基因，早期也用于植物的转基因。第70页,共89页，星期六，2024年，5月10.病毒颗粒转导法（3）类型：带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因打随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上，这样以后不需要再包装成病毒颗粒。带有目的基因的病毒是缺陷型的，需同另一辅助病毒一起感染受体细胞，在受体细胞内包装成新的病毒颗粒。虽然带有目的基因的SV40早期转录是缺陷型的，但被感染的cos细胞系的基因组中整合的SV40早期转录区段DNA，所以无需辅助病毒做混合感染。第71页,共89页，星期六，2024年，5月11.磷酸钙转染法（1）原理：哺乳动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。（2）基本操作过程：将待转染的外源DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不断搅拌的Hepers-磷酸钙溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物；用吸管将沉淀复合物黏附在哺乳动物单层培养细胞表面；保温几小时后，用新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养茹继续培养，直至外源基因表达。第72页,共89页，星期六，2024年，5月11.磷酸钙转染