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流感病毒RNA荧光RTPCR检测技术样本--第1页

流感病毒RNA荧光RT-PCR检测技术

实时荧光定量PCR是在常规PCR基本上发展起来定量PCR技术，通过在PCR反映体系中加入

荧光基团，运用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程，最后依照ct值和原则曲线，对未

知模版进行定量分析。惯用实时荧光定量PCR又分为非特异性荧光标记SYBRGreen法和特

异性荧光标记TaqMan法和分子信标法。

一、实时荧光定量PCR原理：

1、SYBRGreen法：

SYBRGreen是一种双链DNA结合染料，游离状态下不发光，非特意地掺入到双

链DNA中后发出荧光信号，其强度与双链DNA数量有关，随着扩增产物量增长，检测到荧光

信号增强。

2、TaqMan法：

在扩增反映液中，加入一特异性探针，该探针5‘端和3’端分别标记一种荧

光报告基团和一种荧光淬灭基团，探针完整时，两基团位置接近，5‘端报告基团荧光能量

被3’端淬灭基团吸取，此时检测不到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成Taq

酶5‘

→3’外切活性底物，当Taq酶沿模板向前延伸到探针结合处时，发生链置换，Taq酶5’

→3’外切活切将探针5‘端连接报告基团从探针上切割下来，5’端报告基团荧光能量脱离

3’端荧光淬灭基团吸取，可检测到荧光信号，每通过一种PCR循环，荧光信号也和扩增产

物同样，有一种同步增长过程。

3、分子信标法：

探针设计成茎环构造发夹状，环部核苷酸序列与扩增产物序列互补，两端核苷酸序列互

补形成茎部，且一端标记有报告基团，另一端标记有淬灭基团，探针未与模板结合时，报告

基团和淬灭基团空间位置接近，报告基团荧光能量被淬灭基团吸取，此时，检测不到荧光信

号，与模板结合后，探针构象由发夹状变化为链状，报告基团和淬灭基团分离，可检测到荧

光信号。

核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组有力办法，虽然基因组含量很低或死病

毒也可以检测到。本章将简介检测流感病毒聚合酶链式反映（PCR）。

流感病毒基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必要合成与病毒RNA互

补DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA多聚酶，因而，扩

增流感病毒基因组过程称为RT-PCR。

RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，

逆转录酶及TaqDNA多聚酶；一方面由逆转录酶将病毒RNA逆转录合成

cDNA，然后再进行聚合酶链反映经25～30个循环，使DNA产物达到倍增效果。

二、试剂器材设备和器械

咽拭子液配制：一瓶MEM液500ml，+8万单位庆大1.25ml，分装在5ml小管中，每管

4ml。小管最佳高压。

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1、RNA提取试剂盒荧光PCR检测试剂盒

提取试剂盒组分：洗脱液（ElutionBuffer）、载体核酸（CarrierRNA）、裂解结合增强

液（Lysis/BindingEnhance）、裂解/结合液（Lysis/BindingSoln）、磁珠（RNABindingBeads）、

洗涤液1（WashSoln1）、洗涤液2（WashSoln2）

荧光PCR检测试剂盒组分：2×RT-PCR反映液（2×RT-PCRBuffer）、25×RT-PCR酶

混合液（25×RT-PCREnzymeMix）、高G/C含量引物/探针检