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ELISA相关因素实验

1包被抗原使用浓度的确定

包被抗原的使用浓度过高，既不经济，又可使本底增高使用浓度过低，则酶标板上有

;

大量位点未吸附抗原，增加了非特异性反应，又影响检测的敏感性。所以必须对包被抗原的

使用浓度予以选择。包被抗原使用浓度的确定采用方阵试验法，用系列浓度的包被抗原包被

96孔酶标板，将抗血清做倍比稀释，采用间接ELISA法测定包被抗原的最佳使用浓度。间接

ELISA法的具体步骤如下:

包板用包被缓冲液将包被抗原稀释成系列浓度，孔，℃过夜。包被抗原的

A.:(CBS)100ul/4

加法如下表;

B.洗板:PBST洗四次，lmin/次;

C.封闭:5%甘氨酸PBST，200ul/孔，37℃，2h;

D.洗板:PBST洗四次，lmin/次;

加一抗加入系列浓度的抗血清，孔，℃，。抗血清加样如下表所示

E.:100ul/37100min;

F.洗板:PBST洗四次，lmin/次;

加二抗倍稀释的酶标山羊抗兔配制，孔，℃，

G.:1600HRPIgG(PBST)100ul/3740min;

H.洗板:PBST洗四次，lmin/次;

1.加底物:200ulTMB储存液+10mL底物缓冲液+7ulHO，各5ul/孔，37℃，15min;

22

J.终止:2MH2S04，50ul/孔;

K.读数:OD450。

包被抗原加样表

包被抗原加样孔号

稀释倍数123456789101112

A25600X

B12800X

C6400X

D3200X

E1600X

F800X

G400X

H100X

抗血清加样表

加抗体稀释倍数

样

1

3456789101112

孔2PBS

PBS51200X25600X12800X6400X3200X1600X800X400X200X100X

号

A

B

C

D

E

F

G

H

2最佳封闭液的选择封闭是指在包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。

抗原或抗体在包被时所使用的浓度较低，抗原或抗体吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙，

封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中其他干扰物质