《前胡分子鉴定技术规程》征求意见稿.docx

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T/ACCEMXXXX—2024

前胡分子鉴定技术规程

1范围

本文件规定了前胡分子鉴定的仪器设备及试剂、溶液配制、引物、操作程序、结果及判定、资料记录和档案管理。

本文件适用于前胡、紫花前胡（基源植物为Angelicadecursiva）、石防风（基源植物为Peucedanumterebinthaceum）和藁本（基源植物为Ligusticumsinense）之间分子鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4仪器设备及试剂

除非另有说明，本文件所用试剂均为分析纯。仪器设备及试剂参见附录A。

5溶液配制

所有用水按GB/T6682的要求，相关溶液配制方法参见附录B。

6引物

6.1通用引物TY3s：5’-GGAATGCGCCAAGG-3’。

6.2通用引物TY3a：5’-TGCGTTCAAAGACTCGA-3’。

6.3特异性引物CP19s：5’-TGGCCACTCCCGGATT-3’。

6.4特异性引物CP19a：5’-GCCTAAGGGTCCTGAATCTC-3’

7操作程序

7.1样品准备

随机抽取5个～10个个体分别取样。对于干燥样品，取50mg；对于新鲜样品，取100mg。

7.2DNA提取

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用CTAB法提取总DNA。具体过程见附录C。

7.3PCR扩增

7.3.1反应体系

反应体系总体积为25μL，反应组分配制如下：

a)DNA模板0.5μL（5ng～50ng）；

b)上游引物1μL（10pmol）；

c)下游引物1μL（10pmol）；

d)10×PCRBuffer2.5μL；

e)MgCl2（25mM）1.5μL；

f)dNTPs（10mM）0.5μL；

g)TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL；

h)ddH2O补足至25μL。

7.3.2反应程序

反应程序可根据引物不同选择下列程序中的一种。

a)程序1：95℃5min、30个循环（每个循环包括95℃30s，55℃30s，72℃30s）、72℃10min；

b)程序2：95℃5min、23个循环（每个循环包括95℃30s，55℃30s，72℃30s）、72℃10min。

注：通用引物TY3s和TY3a用程序1，特异性引物CP19s和CP19a用程序2。

7.4DNA质量检测

反应程序1结束后，分别取5μL扩增反应产物，经琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析仪中观察并拍照。实验中设置无模板DNA的空白对照、阴性对照和阳性对照。实验重复3次。

7.5PCR产物检测

反应程序2结束后，分别取5μL扩增反应产物，经琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析仪中观察并拍照。实验中设置无模板DNA的空白对照、阴性对照和阳性对照。实验重复3次。

7.6数据采集

7.6.1DNA质量检测

能扩增出DNA条带的数据记录为1；不能扩增出DNA条带的数据记录为0。

7.6.2PCR产物检测

能扩增出DNA条带的数据记录为1；不能扩增出DNA条带的数据记录为0。

8结果及判定

8.1DNA质量检测

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如果数据记录为1，判定为该样品的DNA质量合格，能用于后续实验；如果数据记录为0，判定为该样品的DNA质量不合格，不能用于后续实验。

8.2PCR产物检测

如果数据记录为1，则所述待测样品中含有中药前胡；如果数据记录为0，则所述待测样品中不含有中药前胡。

9资料记录和档案管理

9.1资料记录

前胡分子鉴定中的DNA质量检测数据和PCR产物检测数据应做详细的记录。9.2档案管理

前胡分子鉴定资料应建立档案并由专人保管，长期保存。

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附录A（资料性）

仪器设备及试剂

A.1主要仪器设备

A.1.1PCR扩增器。

A.1.2电泳仪。

A.1.3电子天平。

A.1.4微量移液器。

A.1.5微波炉。