DB2305T 020-2024 牛病毒性腹泻病毒PCR检测规程.docx

ICS 65.020.30

CCS B41

DB 2305

双 鸭 山 市 地 方 标 准

DB2305/T020—2024

牛病毒性腹泻病毒PCR检测规程

2024-08-20发布 2024-09-20实施

双鸭山市市场监督管理局发布

DB2305/T020—2024

DB2305/T020—2024

目 次

前 言 Ⅱ

范围 1

规范性引用文件 1

术语和定义 1

缩略语 1

主要仪器设备 1

试剂 2

样品的采集与处理 3

样品采集 3

样品处理 3

样品病毒核酸RNA提取 3

PCR扩增 3

引物 3

反应条件 4

结果判定 4

检测结果成立条件 4

结果判定 4

实验室无害化处理 4

病料的无害化处理 4

实验室废弃物处理 4

实验室分区 4

实验室生物安全管理 4

前 言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由双鸭市农业农村局提出并归口。

本文件起草单位：双鸭市农业技术综合服务中心、双鸭山市基本建设项目服务中心、黑龙江农业职业技术学院。

本文件主要起草人：王宇婷、白鹭、刘云、张红军、杜航、张荣翔、秦藕菊。

II

DB2305/T020—2024

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牛病毒性腹泻病毒PCR检测规程

范围

本文件规定了牛病毒性腹泻病毒PCR检测方法的主要仪器设备、试剂、样品采集与处理、样品病毒核酸RNA提取，PCR扩增、结果判定、实验室无害化处理等技术要求。

本文件适用于牛病毒性腹泻病毒PCR检测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

缩略语

下列缩略语适用于本文件。BVDV：牛病毒性腹泻病毒PCR：聚合酶链式反应

RNA：核糖核酸

cDNA：与信使RNA链呈互补的碱基序列的单链DNAPBS：磷酸盐缓冲液

EP管：微量离心管DEPC：焦碳酸乙二酯EDTA：乙二胺四乙酸

PrimeSTARBuffer：聚合酶的缓冲液dNTPMix：脱氧核糖核苷三磷酸混合液

DNAPolymerase：高扩增效率的PCR用的DNA聚合酶ddH2O：双蒸水

主要仪器设备

二级生物安全柜

台式高速冷冻离心机：可控温至4℃，转速12000r/min以上5.3 冰箱：2℃～8℃、-20℃、-70℃三种

单道（或多道）微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）

PCR仪

涡旋振荡器

电泳仪

水平电泳槽

凝胶成像系统

全自动高压灭菌锅

电子天平：精密度0.001g

通风橱

pH计

试剂

在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682三级水要求。所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装。

TRIzol、氯仿、异丙醇（-20℃），均为商品化试剂。

无水乙醇，应于-20℃预冷。

DNA相对分子质量标准物MarkerDL2000。

75%乙醇：量取75mL无水乙醇，加入25mL0.1%DEPC水，应于-20℃预冷。

0.1%DEPC水：将0.1gDEPC加100mL三级水中，充分振荡后作用12h，121℃高压灭菌30min,

冷却后冷藏备用，在通风橱中配制。

30%甘油磷酸盐缓冲液：甘油30mL，氯化钠（Nacl）4.2g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1g，磷酸氢二钾（K2HPO4）3.1g，0.02%酚红1.5mL，加三级水定容至100mL，加热熔化，校正Ph为7.6，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。

50×TAE：称取242gTris、37.2gNa2EDTA·2H2O溶于800mL三级水中，充分搅拌混匀，加入

57.1mL的冰乙酸，充分混匀，加三级水定容至1L，室温保存。

1×TAE：取20mL50×TAE，加三级水定容至1L，室温保存。

cDNA合成：反转录试剂盒。

10mg/mL