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利用不同的方法筛选和鉴定转化子--第1页
利用不同的方法筛选和鉴定转化子
摘要:
通过使用不同的方法,从大肠杆菌中筛选和鉴定出转入了GFP基因并表达出GFP的
菌株。实验先用蓝白斑筛选得到含有载体的转化子,之后用菌落PCR对其中的重组子进行
进一步鉴定,最终通过对表达的产物的检测确证是否能表达出GFP。实验结果表明挑选出
来的菌株并没有表达出GFP,需要挑选其他菌落继续实验。
关键词:
蓝白斑筛选、菌落PCR、GFP、蛋白质检测
前言
我们采用的是目前应用最广泛、技术最成熟、同时也是最经典的微生物基因重组,作为
载体的质粒,我们需要选择或者构建带有多克隆位点和带有抗性基因的质粒,前者有利于基
因顺利导入到受体细胞,后者方便我们对转化产物进行筛选;对于受体细胞,我们所选择使
用的大肠杆菌,具有遗传背景清楚,结构简单,表达效率高,容易获取等优点,已经建立起
一套完善成熟的表达系统,是目前转基因领域最受欢迎、使用最普遍的系统之一。
GFP自从发现以来,已经获得了广泛充足的应用,是生物领域的重要材料绿。绿色荧
光蛋白本身无毒,且不需要其他辅酶或者反应底物,在紫外或者蓝光激发下就可以自主发光,
而且有较好的稳定性,当其基因与其他蛋白质表达基因相融合时,该蛋白质既能保持原有活
性,发光能力也不受影响,这意味着我们可以将GFP与我们想要了解的蛋白质相接合在一
起,将GFP作为荧光标签,对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等机理进行追踪和
观察,因为这种特性,绿色荧光蛋白具有其他报告蛋白无法比拟的优点,已经在生物研究中
获得广泛的应用。
我们已经通过一系列的实验操作,获取GFP基因,用PCR技术将其扩增并连接到载体
质粒pMD19-TVector上,用CaCl法将其转入到大肠杆菌中,经过本次实验的筛选和鉴定,
2
构成了完整的转基因操作流程,将我们的课堂学习和实际操作结合起来,从而对转基因技术
有一个最直接的认识。尽管在当下中国,转基因技术备受争议,但是每一名生物专业的学生,
都应学习了解国际科学社会在转基因领域上所取得的巨大成就,并看到其广泛的应用前景和
巨大的市场潜力,同时将所学习到的关于转基因知识科普出去,让每一个公民都能科学、正
确地认识转基因,理性、客观地参与到关于转基因的有益讨论中去,推进我国生物科学技术
的发展。
利用不同的方法筛选和鉴定转化子--第1页
利用不同的方法筛选和鉴定转化子--第2页
一、材料、试剂和器具
1.材料
转化菌液:经过转化操作的E.coliDH5α菌株(R-,M-,Amp-或者含pMD19-TVector)
2.试剂
含氨苄青霉素(Amp,100mg/L)的LB固体培养基、LB液体培养基、X-gal(200mg/ml)
储存液、IPTG储存液(20mg/ml)、10×PCRbuffer、rTaq酶、dNTPmixtures(dATP,dTTP,
dGTP,dCTP)、无菌蒸馏水、1.5%琼脂糖凝胶、矿物油、DNAmaker、1×10LoadingBuffer
引物溶液(P1、P2各10μM)
P1:GFP-F:5-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3(Tm=65.5℃)(SalI)
P2:GFP-R:5-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3(Tm=61.5℃)(XbaI)
3.器具
超净工作台、涂布器
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