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《第3章基因工程》
第2节基因工程的基本操作程序
必会知识考点梳理拓展延伸易错警示
必会知识一目的基因的筛选与获取
1.目的基因主要是指编码蛋白质的基因,如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等
相关的基因。
2.获取目的基因的方法
(1)从基因文库中获取目的基因
①基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别
含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。
②基因文库的种类:基因组文库:包含一种生物所有的基因;部分基因文库:只包含一种生物的一部
分基因,如cDNA文库。cDNA文库与基因组文库的区别
文库类型cDNA文库基因组文库
文库大小小大
基因中启动子(具有启动作用的无有
DNA片段)
基因中内含子(位于编码蛋白无有
质序列内的非编码DNA片段)
基因数量某种生物的部分基因某种生物的全部基因
物种间的基因交流可以部分基因可以
③从基因文库中获取目的基因的方法:用DNA探针从基因文库中准确提取目的基因。根据目的基因的
核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链,并用同位素标记,即成为探针。基因文库中变性的DNA片段,
如果有一个DNA片段能和探针片段互补结合成杂交链,这一片段即含有所需的目的基因。
(2)利用PCR获得和扩增目的基因
①含义:PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA
复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。需要具备的条件有模板、原
料、引物、酶、控制温度等。
②原理:利用DNA半保留复制原理,在体外将目的基因的核苷酸序列不断地加以复制,使其数量成指
n
数形式扩增(约为2,其中为扩增循环的次数)。
③前提:有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。
④PCR的反应及其作用
条件作用
在一定的缓冲液提供相对稳定的pH环境;真核细胞和细菌的DNA聚合酶都
2+2+
(含Mg)中进行需要Mg激活
4种脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料
DNA母链作为DNA复制的模板
Taq酶(耐高温)催化合成DNA子链
引物使Taq酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸
温度90℃以上变性:使DNA片段双链解开
控制50℃左右复性:使解开的两条DNA单链分别与相应的引物结合(退火)
72℃左右延伸:Taq酶催化子链合成
⑤扩增的过程:
第一步:将反应体系(包括双链模板、引物、Taq酶、4种脱氧核苷酸以及酶促反应所需的离子等)加热
至90℃以上,使双链DNA两条链之间的氢键打开,变成单链,分别作为聚合反应的模板。
第二步:将反应体系降温至50℃左右,使引物分别与模板DNA链3端的相应序列互补配对,这个过程
称为复性。
第三步:将反应体系升温至72℃左右,在Taq酶的催化作用下,将与模板DNA互补的单个核苷酸加到
引物所提供的3—OH上,使DNA链延伸,产生一条与模板链互补的单链DNA。如图所示:
上述三步反应完成后,一个DNA片段就变成了两个DNA片段,随着重复次数的增多,DNA的数量就
n
以约2的倍数增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪(PCR仪)中完成的。完成后,常采用琼脂糖凝胶电
泳来鉴定PCR产物。
必会知识二基因表达载体的构建
1.基因表达载体的构建
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