基于发光金纳米粒子荧光增强法测定溶菌酶.docx

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基于发光金纳米粒子荧光增强法测定溶菌酶

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摘要参照文献方法合成了BSA修饰的水溶性发光金纳米粒子，并考察了其与溶菌酶之间的相互作用。依据溶菌酶对金纳米粒子的发光增强现象，建立了测定溶菌酶的荧光新方法。考察了发光金纳米粒子的浓度、pH值、反应时间及共存物质对测定的影响。优化条件为：发光金纳米粒子浓度4.0×10－6mol/L、pH7.0、反应时间10min。在此条件下，荧光增强与溶菌酶浓度在2×10－7～8×10－6mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为3.0×10－8mol/L。对4.0×10－6mol/L溶菌酶平行测定6次，相对标准偏差为2.6%。本方法具有灵敏度高、探针水溶性好和生物毒性低的优点，同时，常见低等电点蛋白质对分析不干扰。本方法用于合成样品及鸡蛋清中溶菌酶含量测定，平均回收率为97.5%～103.6%。

关键词溶菌酶；发光金纳米粒子；荧光方法

1引言

溶菌酶是一种高等电点的酶\,广泛存在于身体组织以及分泌物中。鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的体液及微生物中也含有此酶,其中蛋清中含量最丰富。溶菌酶具有天然、易消化、易吸收、无毒性等优点,并具有溶解一些细菌的特性\。从鸡蛋清中提取的溶菌酶\还可以替代一些化学合成药物，用于食品防腐\。此外，研究表明，尿液和血清中溶菌酶的增加会导致白血病\，肾脏疾病\和脑膜炎\等。因此，溶菌酶已被广泛应用于生物工程和医疗领域。目前，有关溶菌酶的分析方法主要有动态浊度法\和溶板法\。近年来，高灵敏测定溶菌酶的荧光方法也有报道,由于溶菌酶本身不具有荧光，一些外源探针，主要是CdSe2/CdS和CdSe以及CdHgTe等发光量子点\被广泛采用。

近年来，纳米尺寸的贵金属粒子由于其独特的发光性能备受关注\。与上述发光量子点相比，直径小于5nm的发光金纳米粒子（Luminescentgoldnanoparticles,GNPs）具有制备简单、生物相容性好等优点，尤其是低毒性探针可能更适合分析一些含生物酶的系统。目前，利用各种方法制备的GNPs已被用于溶液中Hg2＋\和Ni2＋\的测定,以及细胞成像分析\。本研究将GNPs应用于TX-100及其临界胶束浓度的测定\。

本研究参照文献\合成了牛血清蛋白（BSA）修饰的GNPs，并考察了它们与溶菌酶及其它常见蛋白质的相互作用。结果表明,随着溶菌酶加入浓度的增加，GNPs的荧光明显增强，而其它低等电点的蛋白质对GNPs的荧光影响很小，据此建立测定溶菌酶的荧光方法，并用于鸡蛋清样品和含蛋白质合成样品中溶菌酶含量的测定，结果令人满意。

2实验部分

2.1仪器与试剂

F-4500荧光分光光度计、U-3010紫外-可见分光光度计（日本Hitachi公司）;JEOL-2010高分辨电镜（HRTEM,日本电子株式会社）；TGL-16C型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）;pH酸度计（杭州东星仪器设备厂）;85-1型磁力搅拌器（江苏金坛正基仪器有限公司）。牛血清白蛋白（BSA，上海生物工程有限公司）;HAuCl4?4H2O（Sigma-Aldrich公司）;溶菌酶（LysozymeChloride，上海迈瑞尔化学技术有限公司）。0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）；其它试剂均为分析纯。水为二次蒸馏水。

2.2实验方法

2.2.1GNPs的制备\将0.125mL1%HAuCl4?4H2O（m/V）稀释至20mL，加入134mgBSA，剧烈搅拌2h，加入30.6mgNaBH4，继续反应24h，高速（11000r/min）离心除去颗粒较大的粒子，保留淡黄色的溶液。

2.2.2样品处理与检测在一系列10mL具塞试管中分别加入0.4mLGNPs溶液，0.5mL0.01mol/LPBS缓冲液，然后加入不同量的标准试剂溶液或样品溶液，稀释到5mL，常温下放置10min后进行荧光测定。测定在室温（20℃）下进行，采用10mm石英液池，激发波长为320nm，激发和发射狭缝宽度为10nm，光电倍增管的负高压为700V。

实验用鸡蛋样品购于芜湖当地市场，将蛋清与蛋黄分开，用PBS缓冲液（pH7.0）将蛋清稀释10倍。取适量上述样品至GNPs溶液中，反应10min后进行荧光测定。

3结果与讨论

3.1发