TCVMA-X29 2019非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法.pdf

ICS11.220

B41

团体标准

T/CVMAX29—2019

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法

MethodOfDropletDigitalPCRForDetectionOfAfricanSwineFeverVirus

2019-XX-XX发布2019-XX-XX实施

中国兽医协会发布

T/CVMAX29—2019

前言

本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由中国兽医协会提出并归口。

本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：原霖、杨林、王传彬、宋晓晖、董浩、倪建强、刘洋、毕一鸣、陈亚娜。

I

T/CVMAX29—2019

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法

1范围

本标准规定了非洲猪瘟病毒(AfricanSwineFeverVirus，ASFV)微滴式数字PCR检测方法的原理、试

剂与耗材、仪器与设备、操作步骤、结果分析。

本标准适用于非洲猪瘟病毒检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3原理

微滴式数字PCR（DropletDigitalPCR，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分成

数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR的一次检测变成数万次检测，提高了

核酸序列检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每

个微滴不含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR

扩增仪上进行终点PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，

没有荧光信号的微滴判读为0。根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷

贝数。

4试剂与耗材

4.1提取

宜选取商品化的病毒DNA提取试剂盒。

4.2微滴式数字PCR扩增试剂

1

T/CVMAX29—2019

宜按照不同的微滴式数字PCR平台的说明书选取推荐的微滴式数字PCR扩增试剂。

4.3引物和探针

ASFV上游引物(ASFVF)：5＇-CGATGATGATKACCTTYGCTBTGA-3＇

ASFV下游引物(ASFVR)：5＇-ATTCTCTTSCTCTGGATACGTTARTATG-3＇

ASFV探针(ASFVP)：5＇-FAM-CCACGSGAGGAATACCAACCBAGTG-BHQ1-3＇

5仪器与设备

生物安全柜、PCR扩增仪、数字PCR微滴发生器、数字PCR微滴检测器、纯水仪、核酸定量仪、涡

旋震荡仪。

6操作步骤

6.1样品采集及运输

按照NY/T541执行。

6.2DNA提取

按照所选取的病毒DNA提取试剂盒说明书进行提取。

6.3微