同型半胱氨酸诱导人血管平滑肌细胞氧化损伤的研究.docx

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同型半胱氨酸诱导人血管平滑肌细胞氧化损伤的研究

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苏娟王树人吴建新秦燕

【摘要】目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人脐静脉血管平滑肌细胞(VSMCs)氧化损伤的作用及机制。方法用含不同剂量Hcy（50~1000μmol/L）的培养基培养VSMCs24h后，以分光光度比色法分别测定细胞内丙二醛(MDA)含量和超氧化物酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力的改变。结果随Hcy浓度增加，VSMCs内MDA的含量明显增加，SOD和CAT的活力也显著升高。Hcy明显促进了VSMCs的氧化。结论Hcy可直接诱导VSMCs的氧化损伤。

【关键词】同型半胱氨酸；平滑肌细胞；氧化损伤

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是近年来确定的致动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)的新的独立的危险因子［1］。研究显示，Hcy含有巯基(-SH)，易发生自身氧化，可生成如超氧化物、过氧化氢和羟自由基等多种强氧化物，启动脂质过氧化链式反应而损伤细胞［2］。Hcy对细胞的氧化作用，以往的研究主要集中在血管内皮细胞上。血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)也是As发生的主要效应细胞，Hcy对其是否有氧化作用却少见报道。本研究旨在探讨Hcy对VSMCs的氧化作用及机制。

1材料和方法

1.1主要实验试剂DMEM/F12培养基(Gibco)、新生牛血清（杭州四季清）、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、D-Hanks液；同型半胱氨酸(Sigma)；MDA、SOD、CAT测定试剂盒（南京建成）。

1.2人VSMCs的体外培养、鉴定与分组采用组织贴块法培养。取无菌的新鲜的人脐带，剪取脐静脉血管中膜部分并剪成约(0.5mm×1mm×1mm~1.0mm×1mm×1mm大小的血管小块，以每3~5mm2块密度均匀种植于培养瓶底。采用DMEM/F12培养液，在37℃、5%CO2培养箱（湿度100%）内静置进行原代培养和传代培养。在倒置显微镜下进行观察，并做α-actin肌动蛋白免疫组化检测。取3~6代细胞用于实验。将细胞分别置于终浓度为0、50、100、200、500、1000μmol/LHcy的培养液中孵育24h，每组重复做5次。

1.3方法细胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，2000转/min离心5min，弃上清液。加入无菌的三蒸水，采用反复冻融法裂解细胞。取上清液按说明书，用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定细胞内丙二醛（MDA）的含量，黄嘌呤氧化法比色测定细胞内超氧化物岐化酶（SOD）的活力，可见光法测定细胞内过氧化氢（CAT）的活力。

1.4统计学方法所有数据用（x±s）表示，进行t检验。采用SPSS13.0软件操作，P0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞内丙二醛（MDA）的含量由表1可见：VSMCs内MDA的含量随Hcy浓度的增加而增加，当Hcy浓度达到500μmol/L以上与对照组有显著差异性。

2.2细胞内超氧化物岐化酶（SOD）的活力在Hcy作用下，VSMCs内SOD的活力明显升高，在低浓度（50μmol/L）时就与对照组有差异性，并呈浓度依赖性升高。

2.3细胞内过氧化氢（CAT）的活力VSMCs内CAT活力也随着Hcy浓度的增加而增加，但在高浓度（1000μmol/L）时才与对照组显示出差异性。

3讨论

Hcy是体内蛋氨酸在代谢过程中经脱甲基等一系列反应形成的一种含硫氨基酸，在体内含量极少。在正常成人体内，血浆Hcy浓度大约为5~15μmol/L。血浆中Hcy浓度15μmol/L称为高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteine,HHcy)。1969年，McCully发现由于维生素B12的代谢障碍以及胱硫醚-β-合成酶(CβS)缺陷均可导致HHcy和类似As的病变；随后他又通过动物模型证实Hcy在血中蓄积可导致类似As的血管病变。据此，McCully提出HHcy与As有关的假说［3］。近年大量的回顾性、前瞻性和实验性研究已确定，血浆中Hcy水平升高是As发病的一个新的独立的危险因素［4］。

Hcy诱发As的机制相当复杂，目前尚未完全明了，研究认为与氧化损伤、细胞凋亡、炎症反应、凝血纤溶异常等作用有关［5］。其中，氧化损伤作用一直是Hcy引发As的研究重点。Tyagi等研究发现，Hcy在过渡金属离子（Fe3+、Cu2+）的存在下易发生自身氧化，生成多种强氧化产物如超氧化物（O-2?）、过氧化氢（H2O2）和羟自由基（?OH）等，产生氧化应激反应，启动膜脂质过氧化链式反应，降低膜流动性并破坏细胞的完整性，导致细胞功能改变，甚至坏死脱落［6］。高键等研究