地高辛标记对旱稻进行southern杂交分析主要影响因素的优化和验证.docx

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地高辛标记对旱稻进行southern杂交分析主要影响因素的优化和验证

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邢文岳++苏乐乐++李朝炜++魏景芳++朱昀

摘要：以转基因旱稻和野生型旱稻为材料，对通过地高辛随机引物标记法进行的旱稻基因组Southern杂交条件进行了优化分析，包括探针制备效率、DNA样品量、酶切体系及转膜时间等。结果表明：影响探针制备效率的首要因素是温度而不是时间；DNA上样量在10～30μg均可以获得高质量的杂交图；60μL体系15h即可酶切彻底并获得良好的杂交效果；转膜时间6h即可。本研究所优化的地高辛标记的旱稻杂交分析结果稳定重复性好，具有较高的灵敏度和信噪比。

关键词：旱稻；地高辛；Southern杂交方法；优化；验证

：S511.01文献标志码：A：1002-1302（2017）08-0041-03

Southernblotting技术于1975年由英国科学家Southern创立，随着该技术的不断发展与普及，目前已成为分析基因结构和检测特定DNA片段的经典技术方法之一[1]。该技术能够在DNA水平检测外源目的基因是否已经转入并成功整合到植物的染色体上，同时对外源片段的拷贝数目进行分析。目前，Southern杂交中标记探针的方法有同位素和非同位素2种。使用同位素标记是最经典的方法，其灵敏度高，能检测出极其微量的信号源，但对试验的条件有比较严格的要求，且会对环境以及实验者的身体造成放射性辐射危害。非同位素标记又分为生物素标记和地高辛标记。由于生物体中并没有地高辛，所以相比于生物素而言，地高辛可以更好地消除内源性背景，应用前景也更为广阔[2]。据报道，棉花[3]、烟草[4]、小麦[5]、油菜[6]、甘蔗[7]、橡胶树[8]、热带果树[9]等植物用地高辛标记的杂交技术均可获得良好的杂交效果。

目前，虽然有地高辛标记探针试剂盒大大方便了试验，但是试剂盒说明书更多地侧重于步骤流程的描述，至于一些技术要点、操作细节、实验注意事项的介绍并不很多。这也直接导致许多试验没能得到满意的结果。本研究以8个不同的LEA家族抗逆旱稻品种为材料，参考前人成功经验，结合本实验室的实际情况，对地高辛标记探针的Southern雜交方法进行探索改进和优化，取得了理想效果，现作一总结。

1材料与方法

1.1试验材料

转基因的T3代旱稻由本实验室通过农杆菌侵染法获得。

1.2试验方法

1.2.1探针标记反应管中加1μg纯化的目的基因DNA片段，加ddH2O至终体积16μL。沸水浴10min变性，迅速插入冰水混合物中，取混匀的地高辛高效引物4μL到变性的DNA中，混匀，37℃孵育20h。加入2μL0.2mol/LEDTA（pH值8.0）或65℃加热10min终止反应。

1.2.2旱稻基因组DNA的提取及纯化采用改良的CTAB[10]法对旱稻基因组进行提取，略加改动。65℃预热15mL提取缓冲液[CTAB30mg/mL，NaCl1.4mol/L，EDTA（pH值8.0）20mmol/L，Tris-HCl（pH值8.0）100mmol/L，β-巯基乙醇0.2%（V/V）]；液氮研磨2.5g植物叶片成粉末后刮入离心管的提取缓冲液中，65℃保温40～60min，每10min轻取出轻摇混匀；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分混匀，静置15min，12000r/min离心15min；转移上清至一新的Eppendorf管，加等体积的氯仿/异戊醇，混匀10min，静置10min，12000r/min离心10min；将上清液转移到新的离心管中，加1倍体积的异丙醇，混匀；-20℃放置1h或过夜，将絮状沉淀转移至一新的离心管中，70%乙醇洗涤，无水乙醇洗涤，吹干溶解；加入适量RNase对样品进行消化，之后分别用酚/氯仿/异戊醇以及氯仿/异戊醇抽提1次，乙醇洗涤沉淀，超净台上吹干，溶于适量TE。用分光光度计测定样品DNA浓度以及D260nm/D280nm比值。

1.2.3样品酶切60μL酶切体系中含30μg纯化的旱稻DNA，250U限制性内切酶（Thermo），6μL10×buffer，补ddH2O至终体积60μL。酶切15h后取2μL电泳，观察旱稻基因组是否酶切彻底。

1.2.4转膜及固定酶切充分的DNA加loadingbuffer混匀，80V电泳约4h，直至溴酚蓝位于凝胶的2/3处。电泳结束后凝胶不做脱嘌呤处理，经NaOH碱变性后参照分子克隆采用毛细管虹吸印迹法转膜，注意为了分清膜的正反面，要在尼龙膜的一角提前做好标记。将转膜之后的琼脂糖凝胶进行检测，若无核酸残留，证明转膜成功。将尼龙膜80℃烘烤2h进行核酸的固定。

1.2.5杂交洗涤将探针沸水浴5min进