DNA芯片的制备详细步骤.pdf

第一部分：基片的制备

第二部分：点样

第三部分：杂交

第四部分：显色系统与信号检测

第一部分：基片的制备

基片是生物芯片的基础，是生化反应的载体。生物芯片以其基片的不同可以分为无机基

片和有机合成物基片。前者主要包括玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠，其上的探针主要

以原位聚合的方法合成；后者主要有特定孔径硝酸纤维膜、尼龙膜和凝胶块等，其上的探针

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主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到基片上去。在选择固相载体

时，应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应、介

质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素。因此制作生物芯片的载体材料必须以

下特征：良好的生物兼容性；足够的稳定性，能够抵抗一定热、酸、碱等条件；表面活性，

表面应具有各种活性基团，以便与各种生物分子连接；良好的光学性质。

基片在使用前一般需活化处理。活化试剂EDC、NHS等通过化学反应在载体表面键合上

活性基团如氨基、环氧化物、巯基、醛基、肼基，以便于与配基相结合，形成具有生物特异

性的亲和载体，用于固定生物活性分子，如蛋白质、核酸、多肽等。不同的载体就有不同的

活化方式，玻璃基片常采用氨基、醛基、巯基这三种修饰方式。

主要材料：玻璃片：普通无色玻璃，规格75×25×1mm质量要求：

主要设备仪器：通风厨一个、烘箱一台

氨基修饰基片的处理流程：

1）玻片的清洗：

取普通载玻片放入95%的浓硫酸与5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片，

浸入25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。

2）玻片的硅烷化：

将清洗后的玻片放入10mM氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilaneAPES)

的无水乙醇溶液浸泡30分钟。用无水乙醇反复清洗几次，晾干后放入烘箱（100-110℃）

烘干。

3）氨基表面的活化：

(1)酰化反应：硅烷化的玻片浸于lmmol二异丙基乙胺和1mmol丙烯酰氯的无水二氯乙烷溶

液中摇晃反应2h，随后用二氯乙烷清洗，烘干。

(2)氨化反应：1mmol氨化反应液的配制：0．67ml的四乙基五胺、0．65ml1.4-对-(3-

氨丙氧基)-丁烷、0.56ml4-氨甲基-1,8-辛二胺、0.66ml4.7.10-三氧-三二唑啉硫酮二

胺、0.52mlN,N-二甲基-1,6-已二胺、0.30ml2-(2-氨乙氧基)乙醇、0。02lml氨基-1,2-

丙二醇和0.73mlJefamine八种氨基化合物溶解于l00ml无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，将酰

化好的玻片置于氨化反应溶液中过夜，反应时摇晃，然后玻片依次用DMF、甲醇和丙酮清洗，

烘干。以上两个反应可以重复．直至所需的连接分子衍生在玻片表面。

(3)表面活化：将上述氨化液处理的玻片用次亚苯基二异硫氰酸盐溶液（phenylenediisothio

cyanate，PDITC)活化2h，192mgPDITC溶于40ml含l0％无水吡啶的DMF中，然后用DMF，二

氯乙烷清洗．干燥。

4）暗盒备用保存

醛基修饰芯片的处理流程：

1）玻片的清洗：

取普通载玻片放入95%的浓硫酸与5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片，

浸入25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。

2）玻片的硅烷化：

将清洗后的玻片放入10mM氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilaneAPES)

的无水乙醇溶液浸泡30分钟。用无水乙醇反复清洗几次，晾干后放入烘箱（100-110℃）

烘干。

3）玻片的醛基化修饰：

将硅烷化的玻片放入10mM对苯二甲醛的丙酮溶液中浸泡30分钟。取出，用超纯水清

洗几次、晾干。

注：此处参考一种醛基修饰的基因芯片基片及其制备方法。百傲目前使用的此方法。

或：将硅烷化的玻片放入5%戊二醛的丙酮溶液中浸泡30分钟。取出，用超纯水清洗几

次、晾干。

4）暗盒备用保存。

巯基修饰芯片的处理流程

1）玻片的清