蛋白质等电点的测定.ppt

关于蛋白质等电点的测定主要内容(1)了解蛋白质的两性解离性质。(2)学习测定蛋白质等电点的方法。第2页,共20页，星期六，2024年，5月蛋白质的解离性质蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：第3页,共20页，星期六，2024年，5月蛋白质的等电点蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。第4页,共20页，星期六，2024年，5月最常用的方法是：①测其溶解度最低时的溶液pH值。②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH③浊度、分光光度法④基于蛋白质与离子交换的作用第5页,共20页，星期六，2024年，5月一、测定溶解度最低时的溶液PH实验原理：借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。第6页,共20页，星期六，2024年，5月器材：水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵试剂：(1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液(2)1.00摩尔／升醋酸溶液(3)0.10摩尔／升醋酸溶液(4)0.01摩尔／升醋酸溶液实验器材与试剂：第7页,共20页，星期六，2024年，5月实验步骤：(1)取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。试管号蒸馏水（ml）0.01M醋酸（ml）0.1M醋酸（ml）1M醋酸（ml）18.40.6——28.7—0.3—38.0—1.0—47.4——1.6第8页,共20页，星期六，2024年，5月(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。第9页,共20页，星期六，2024年，5月二、等电聚焦电泳原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸到碱逐步变化。第10页,共20页，星期六，2024年，5月2)各种蛋白质pI不同3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH梯度以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。第11页,共20页，星期六，2024年，5月三、实验试剂与仪器1）两性电解质2）30％丙烯酰胺溶液3）TEMED4）10％过硫酸铵溶液5）负极缓冲液：0.1MNaOH正极缓冲液：0.1M磷酸或硫酸固定液：10％（W/V）三氯乙酸染色液脱色液蛋白质等电点标准电泳仪圆盘电泳槽第12页,共20页，星期六，2024年，5月图聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

(A为正面,B为剖面)第13页,共20页，星期六，2024年，5月四、操作方法1.凝胶柱的制备（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中（2）配胶表10mL7.5%凝胶的配制试剂名称 体积(mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 蒸馏水 6.7510%过硫酸铵 0.0510%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 混匀后置真空干燥器中抽气10min 第14页,共20页，星期六，2024年，5月（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1cm处，再用注射器缓缓加水3-5mm高。（4）待凝胶聚合2.电泳 将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L氢氧化钠溶液