蛋白质化学蛋白质结构与功能的关系.ppt

凝胶电泳第63页,共76页，星期六，2024年，5月（四）层析（色谱）层析(chromatography)分离蛋白质的原理当流动相带着待分离蛋白质溶液经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。第64页,共76页，星期六，2024年，5月蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gelfiltration)又称分子筛层析、分子排阻色谱等，是利用各蛋白质分子大小的不同进行分离的。亲和层析：是吸附层析，依赖于蛋白质和其配体（ligand）之间的相互作用来实现分离的。第65页,共76页，星期六，2024年，5月阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质高离子强度洗脱液洗高离子强度洗脱液洗加样平衡液洗收集第66页,共76页，星期六，2024年，5月凝胶过滤层析过程第67页,共76页，星期六，2024年，5月第68页,共76页，星期六，2024年，5月亲和层析过程第69页,共76页，星期六，2024年，5月 混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离分配层析（色谱）根据流动相当不同可以分为气相色谱和液相色谱，液相色谱中最常用的是高压液相色谱第70页,共76页，星期六，2024年，5月高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)也称高压液相层析（highpressureliquidchromatography）。这是近二十年内发展起来的一项快速、灵敏、高效的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论，利用高压输送流动相，拥有高效固定相及高灵敏度检测器，具有气相层析的全部优点。第71页,共76页，星期六，2024年，5月（五）超速离心*超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。第72页,共76页，星期六，2024年，5月因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。第73页,共76页，星期六，2024年，5月2、渗透压法3、超速离心法4、凝胶过滤法5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分子量的测定1、最小分子量测定法：第74页,共76页，星期六，2024年，5月蛋白质含量的测定1、凯氏定氮法2、双缩脲反应3、Folin-酚试剂反应4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法第75页,共76页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第76页,共76页，星期六，2024年，5月******蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。第31页,共76页，星期六，2024年，5月疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病第32页,共76页，星期六，2024年，5月第六节蛋白质的性质与分离、分析技术第33页,共76页，星期六，2024年，5月一、蛋白质的性质相对分子质量很大，一般介于10000-1000000道尔顿之间，也有更大的。测定分子量的方法很多：渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。（一）蛋白质相对分子质量第34页,共76页，星期六，2024年，5月（二）蛋白质的两性性质及等电点蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，