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四川大学实验报告

题目：目的基因双酶切和电泳纯化胶回收

一．实验目的:

1.学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法；

2.练习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。

3.学习核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。

二．实验原理

1.限制性核酸内切酶：

生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切

核酸酶。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名

限制性内切酶(简称限制酶)。

2.切割序列：

（1）BamHⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：

5?G↓GATCC?3→5?GGATCC?3

3?CCTAG↑G?5→3?CCTAGG?5

（2）EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：

5?G↓AATTC?3→5?GAATTC?3

3?CTTAA↑G?5→3?CTTAAG?5

3.为什么要选择表达载体质粒pET-28a？

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pET原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。目的基因

被

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克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控

制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。

宿主菌带有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，可以通过

IPTG来启动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于

表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占

到细胞总蛋白的50％以上。

4.限制性内切酶的选择：选择BamHI、NotI两个位点

由于实验中须将质粒pEGFP-N3上所需的目的基因切下并连

接到载体质粒pET-28a上，所以选择的限制酶需满足以下几

个要求：一．选择两种在质粒pEGFP-N3和载体质粒pET-28a

上都有酶切位点的限制性酶切酶，以保证切下的目的基因和

载体质粒分别都有两个不同的末端，这样可以防止：

（1）质粒和目的基因的自身环化；

（2）质粒与质粒、目的基因与目的基因相互自身连接；

（3）质粒与目的基因反向连接）

二．两种限制性内切酶的酶切位点需满足：

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（1）不破坏目的基因；

（2）在质粒pEGFP-N3和载体质粒pET-28a上都有且只有一

个酶切位点；

（3）在载体质粒上的切割位点距离尽量短些，并且不破坏

载体质粒的启动子等关键序列。

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pET-28a和质粒pEGFP-N3的酶切位点示意图：载体质粒

图一、pET-28a的酶切位点示意图图二、质粒pEGFP-N3的酶切位点示意图

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图三、pEGFP-N3MCS多酶切位点示意图

5.琼脂糖凝胶回收）在酶切的过程中，除产生我们所需要

的目的片段外，还会产生1（去除这一些小片段，这些小片

段可能会与载体连接，从而产生干扰，些小片段的最好方