DB63T 2291-2024 青稞育成品种DNA指纹图谱鉴别规范.docxVIP

ICS65.020.20CCSB21

DB63

青海省地方标准

DB63/T2291—2024

青稞育成品种DNA指纹图谱鉴别规范

2024-6-19发布2024-7-25实施

青海省市场监督管理局发布

I

DB63/T2291—2024

前言

本文件按照GB/T1.1─2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由青海省农业农村厅提出并归口。

本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站、海南州农牧业综合服务中心、青海省乡村产业发展指导中心。

本文件主要起草人：徐金青、沈裕虎、王蕾、王寒冬、边海燕、韩文婷、陈同睿、王焕强、薛明珍、包天忠、李俊仁、李春桥、王健斌、赵璨、尤恩、邓超。

本文件由青海省农业农村厅监督实施。

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DB63/T2291—2024

标准名称

1范围

本文件规定了青稞（Hordeumvulgarevar.nudumHook.f.）育成品种DNA指纹图谱采集的术语和定义、仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息、操作步骤、育成品种DNA指纹图谱和品种鉴别等技术要求。

本文件适用于青稞育成品种DNA指纹图谱的采集，并对照鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验GB4404.1粮食作物种子第1部分：禾谷类GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法

GB/T30988多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法

GB/T34265Sanger法测序技术指南

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

SNP标记

基于单核苷酸多态性的分子标记。3.2

DNA指纹图谱

通过DNA检测技术，获得由多个位点上的等位基因组成的长度不等的特征图纹。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA：脱氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicAcid）

SNP：单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism）

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PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

5仪器设备及试剂

见附录A。超纯水符合GB/T6682的要求，所用试剂为分析纯。

6溶液配制见附录B。

7引物信息见附录C。

8操作步骤

8.1样品准备

8.1.1扦样

种子质量应符合GB4404.1的要求。按照GB/T3543.2的规定，各待检品种分别进行扦样、分样；每品种籽粒分为3份，一份用于检测，一份留作复检，另一份用于备份。

8.1.2发芽

按照GB/T3543.4的规定进行发芽，发芽的籽粒数需大于等于50粒。

8.1.3叶片采取

随机选取三叶一心植株10株，采取叶片混样进行样品制备。

8.2DNA样品制备

8.2.1DNA提取

按照GB/T19495.3的方法或采用商用的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取。8.2.2DNA质量检测

按照GB/T30988中的DNA纯度、浓度测试进行DNA质量检测。

8.3PCR扩增

8.3.1反应体系

将附录C中引物稀释至10μmol/L，DNA浓度稀释至100ng/μl~200ng/μl。反应体系为25μl,包含10×PCR反应缓冲液2μl，2.5mmol/LdNTP溶液1.6μl，10μmol/L正向引物0.5μl，10μmol/L反向引物0.5μl，TaqDNA聚合酶0.2μl，超纯水18.2μl，样品DNA2μl。

8.3.2反应程序

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94℃预变性4min；95℃变性30s，不同引物按照附录C设置退火温度退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

8.4扩增产物检测和测序

按照GB/T30988中的琼脂糖凝胶电泳法进行电泳检测，按照GB/T34