腺病毒的扩增及纯化.doc

重组腺病毒构建，扩增及纯化根本技术操作

〔细菌内同源重组AdEasySystem〕

一目的基因的克隆〔以pshuttle-CMV质粒为例〕

1.?????选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。

2.?????重组质粒鉴定：酶切鉴定或测序。

3.?????重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。

4.?????用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。

5.?????胶回收线性化质粒，以备共转化使用。

二共转化

1?大肠杆菌BJ5183电转感受态制备

2??????从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌，接种于LB培养基中，37℃振摇过夜。

2??????接种25ml过夜培养物于500mlLB培养基，37℃振摇，至OD600到达0.4。

2??????迅速将培养物置于冰浴中30min，至充分冷却。

2??????将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以2500r/min离心15min，弃培养液，回收细胞。

2??????以10ml预冷的10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。

2??????加约1ml〔适量〕预冷的10%甘油重悬沉淀，稀释悬液100倍，测量OD600，至稀释浓度为2-3×1010个细胞/ml(1.0OD600约2.5×1010个细胞/ml)。分装，-80℃或液氮保存待用。

2?病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。

3?将1-5μl(约1μg)线性化的穿梭质粒及1μl〔约100ng/μl〕病毒骨架质粒〔如pAdEasy-1〕参加至含约40μlBJ5183电转感受态的EP管中混匀,冰上冷却。

4?将混合物参加电转杯，电击〔1250-1500V/mm,5ms〕。

5?电击结束取出样品，参加1mlSOC或LB培养液，37℃低速振荡40min。

6?取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板〔25-50mg/ml〕，37℃培养16-20hr。

7?次日挑取平板上长出的菌落〔选择最小的菌落〕,接种于3ml含25-50mg/ml的LB培养基，37℃培养10-15hr。

8?碱裂法提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳筛选，大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定。以PacI单酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段〔约30kb〕,及一条小片段〔约3.0或4.5kb〕〔同时可进行其它酶切鉴定〕，那么根本确定为阳性克隆。

9?取1-5μl阳性质粒转化至DH5α大肠杆菌细胞〔BJ5183为recA+,质粒DNA易发生突变，DH5α或JM109，XL1-blue菌株为重组缺陷性菌株，可稳定扩增已鉴定的重组质粒〕，扩增细菌并纯化质粒。

三重组病毒质粒转导293细胞

1?293细胞培养：转导24小时前，以方瓶为例，接种2×106?293细胞于25cm2方瓶，使生长密度约50-70%。〔也可以使用6孔或96孔板〕

2?以PacI单酶切重组病毒质粒〔转导25cm2方瓶约需4μgDNA〕，完全线性化后，乙醇沉淀，再以20μlddH2O溶解。

3?脂质体包裹质粒〔以Lipofectamine为例〕:每4μgPacI约需20μlLipofectamine包裹.质粒及脂质体分别稀释于500μl无血清培养基再混合,置于室温下15-30min。

4?以无血清培养基轻轻洗涤培养瓶，另加2.5ml无血清培养基，37℃放置10min。

5?将Lipofectamine-DNA混合物参加培养瓶，37℃孵箱放置4hr。

6?4hr后，弃Lipofectamine-DNA混合液，另参加6mlDMEM完全培养基〔含10%FCS〕。如有大量细胞漂浮，可不弃Lipofectamine-DNA液，参加6mlDMEM完全培养基，37℃孵育过夜，再换液。

7?培养过程中观察细胞生长情况。约2周后可观察到细胞病变〔CPE〕出现〔如用pAdTrack-CMV质粒，由于含GFP，可观察到绿色荧光〕。

四重组病毒鉴定

1?转导10-14d后，收集细胞沉淀，参加2ml灭菌的PBS混悬，冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃。

2?取30-50%步骤1中上清，感染50-70%饱和度的25cm2方瓶中293细胞。2-3d后出现明显细胞病变。

3?感染后3-5d,当1/3-1/2细胞漂浮时收集病毒。按步骤1收集细胞并准备病毒上清。通过Westernblot和/或PCR鉴定重组腺病毒产生。

4?PCR鉴定重组病毒。取5μl病毒上清参加10μl蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，离心后取1-2μl作PCR。

五重组病毒扩增，纯化

1?75cm2方瓶中接种293细胞，至密度到达90%，参加适量病毒上清