猪主要病毒性腹泻病毒鉴别检测 多重反转录聚合酶链反应法.docx

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FORMTEXT广西壮族自治区地方标准

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FORMTEXT猪主要病毒性腹泻病毒鉴别检测多重反转录聚合酶链反应法

FORMTEXTEstablishmentofamultiplexRT-PCRfordifferentialdetectionofmajorporcineviraldiarrheaviruses

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FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布

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FORMTEXT广西壮族自治区市场监督管理局???发布

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范围

本标准规定了用于鉴别检测猪主要病毒性腹泻病毒的多重反转录聚合酶链反应法技术规范，包括术语和定义、材料准备、操作方法及结果判定。

本标准适用于采用多重反转录聚合酶链反应法鉴别猪主要病毒性腹泻病毒的检测。

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

猪流行性腹泻病毒?porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV

属于冠状病毒科冠状病毒属成员，为有囊膜的单股正链核糖核酸（RNA）病毒。

猪传染性胃肠炎病毒porcinetransmissiblegastroenteritisvirus，TGEV

属于冠状病毒科冠状病毒属成员，为单股正链RNA?病毒。

猪轮状病毒porcinerotavirus，PoRV

属于呼肠孤病毒科轮状病毒属成员，为双股多节段?RNA?病毒。

猪德尔塔冠状病毒porcinedeltacoronavirus，PDCoV

属于冠状病毒科冠状病毒属成员，为有囊膜的单股正链?RNA?病毒。

反转录reversetranscription，RT

以?RNA?为模板合成互补脱氧核糖核酸（cDNA）的过程。

聚合酶链反应??polymerasechainreaction，PCR

一种在体外快速扩增特定脱氧核糖核酸（DNA）片段的方法。由热变性→复性→延伸三步反应组成一个循环，经多次循环反应，使目的?DNA?得以大量扩增。

多重聚合酶链反应??multiplexpolymerasechainreaction，Multi-PCR

简称多重?PCR，是?PCR?技术的一种特殊形式。指在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增多个模板的?PCR?技术。

材料准备

试剂

特异性引物

引物序列见附录?A?中的表?A.1，上游、下游引物的使用浓度均为?25?pmol/μL。

RNA抽提试剂盒

商品化的?RNA?抽提试剂盒主要成分见应按附录?B?中的?B.1，使用前经技术验证合格。

RT-PCR试剂盒

商品化的?RT-PCR?试剂盒主要成分应按附录?B?中的?B.2，使用前经技术验证合格。

电泳缓冲液

商品化的电泳缓冲液主要成分应按附录?B?中的?B.3，使用前经技术验证合格。

仪器设备及耗材

仪器设备

仪器设备如下：

a）生物安全柜；

b）普通PCR仪；

c）高速台式冷冻离心机；

d）漩涡振荡器；

e）组织匀浆机或研钵；

f）凝胶成像系统；

g）微量移液器；

h）水平电泳仪。

一次性耗材

一次性耗材如下：

a）乳胶手套；

b）Eppendorf(EP)管；

c）PCR管；

d）吸头。

EP?管、PCR?管、吸头等使用无?RNA?酶的一次性塑料制品，否则在使用前经?DEPC?水处理，然后用1.034×105Pa高压灭菌?30min。

操作方法

操作环境

有相应的生物安全设施和不同功能分区，如样品处理区、核酸提取区、样品配液区、PCR?扩增区、结果观察区等，各功能区须有专用试剂和实验耗材，不可交叉混用。操作时，应在生物安全?Ⅱ?级或?Ⅱ级以上防护实验室内、无?RNA?酶的环境下进行。

待检样品处理

处理方法如下：

——组织样品：采取病猪的小肠组织约?1g，置于?2.0mLEP?管中，加入灭菌的?1mol/LPBS（pH7.2）1mL，用组织匀浆机或研钵充分研磨后，反复冻融?3?次；以?10000?×g离心?5min，收集上清，用于总?RNA?抽提，或置?-20?℃?保存备用。

——肛拭子、粪便拭子样品：置于?2.0mLEP管中，加入灭菌