动物细胞工程制药课件.pptx

动物细胞工程制药;第一节概述;第二节动物细胞的形态

和生理特点;⒈贴壁细胞

生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。

两种形态：

成纤维细胞型上皮细胞型;⒉悬浮细胞

生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。

⒊兼性贴壁细胞

生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。

;二、动物细胞的化学组成和代谢;三、动物细胞的生理特点;⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。

⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。

原代培养

有限细胞系

无限细胞系;⒋动物细胞对周围环境十分敏感;

对理化因素敏感，如：

渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等。

;⒌动物细胞对培养基要求高

必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。;⒍动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。

动物细胞蛋白质的合成部位：

游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。

粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。;动物细胞生产药物

缺点:培养条件高、成本贵、产量低。

优点:分泌胞外、纯化方便、翻译

后修饰糖基化，与天然产品一致。;第三节生产用动物细胞的

要求和获得;二、生产用动物细胞的获得;⒉二倍体细胞系

原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。;二倍体细胞有正常细胞的

特点：

①染色体组型是2n核型；

②贴壁依赖接触抑制；

③可传代培养50代；

④无致瘤性。

;⒊转化细胞系

通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的，和人工的，从肿瘤组织中。;4.融合细胞系

细胞融合是指两个或以上的细胞合并成一个细胞的过程。

仙台病毒融合法

聚乙二醇融合法

电融合法

5.重组工程细胞系;三、基因工程细胞构建和

筛选;⒈真核细胞基因表达载体的构建

使用的载体有两类：

㈠病毒载体

牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、

杆状病毒

㈡质粒载体;牛痘病毒：

用构建多价疫苗

腺病毒、逆转录病毒：

用于基因治疗。

杆状病毒：

用于外源基因表达。;杆状病毒作为载体的优点：

①双链DNA，易重组

②插入7～8kbDNA不影响正常病毒粒子的形成。

③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；

④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%～30%；

;⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆。

⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因。;质粒载体在细菌和哺乳动物细胞

体内都能扩增。都含有如下基本

成分：

①允许载体在细菌体内扩增的质

粒序列。

②含有使基因表达的调控元件。;③能用以筛选出外源基因已整

合的选择标记。

④有时还带有选择性增加拷贝

数的扩增系统。;⒉基因载体的导入和高效表达工程细胞株

的筛选

;磷酸钙沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸钙沉淀，DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA－磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞

吞噬作用而将DNA导入。

;电穿孔法：

借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源DNA沿小孔进入细胞。转化率较高，拷贝数低。

;四、常用生产用动物细胞的特性;BHK-21:地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。

成功案例：重组凝血因子Ⅷ，治疗甲型血友病。;C127细胞：是源自RIII小鼠乳癌的未经转化的克隆株。最近常用作牛乳头瘤病毒DNA质粒转化的合适受体。450元。

成功案例：重组人生长激素;CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。

案例：组织型纤溶酶原激活剂(治疗心肌梗死等血栓病)，红细胞生成素EPO(用于肾衰竭和艾滋病中增加红细胞)，乙型肝炎表面抗原，粒细胞集落刺激因子，凝血因子Ⅷ，DNA酶Ⅰ等。

;COS细胞：是用克隆在大肠杆菌质粒载体上其复制起点失活的SV40早期区段DNA，转化正常的猿猴受体细胞CV-1而得到的。

细胞来源广，易培养和转染；能使质粒以高拷贝扩增；产物易回收和分析。

MDCK细胞：从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离。以前用于生产兽用疫苗。最近表达MMP13金属