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彗星实验

彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。

实验原理：它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA向正极迁移形成彗星状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。

实验材料：

玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液（PH13,200mMNaOH,1MmEDTA）、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。

实验步骤：

制片：配制1%的琼脂糖凝胶，于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用；

细胞处理：将细胞消化收集，离心后吸弃上清，用预冷的1*PBS清洗细胞一次，以1*10^5细胞/ml悬浮细胞；

铺胶：将细胞与凝胶以一定的比例（1：10）混匀后迅速滴于玻片上，在显微镜下观察细胞的数目（注意调整比例及铺板均匀），4℃黑暗环境中固化10min；

裂解：轻轻取出玻片，将玻片浸于预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解30-60min;

解旋：从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3次，每次3mim,用纸巾吸去玻片上的液体，置于水平电泳槽，加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上，避光解旋30min;

电泳：电压30V,电流300Ma,电泳30min。

漂洗及染色：电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2次，每次15min,以中和强碱。滴加DAPI染色，立即置于荧光显微镜下观察。

结果观察：

荧光显微镜下20倍波长，激发波长377nm，发射波长477nm。每一个视野观察50个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率=（拖尾细胞数/50）*100%。每个视野用目镜测微尺测量30个细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（TL）=全长-头长，计算各剂量组的平均尾长。