流式细胞术课件.ppt

第二章流式细胞术的应用;第一节流式细胞周期与DNA倍体分析

1．细胞周期和倍体的概念

(1)细胞周期:从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累，到下一次细胞分裂结束为止，称为一个细胞周期;G1期(DNA合成前期):如果诱导细胞分裂，细胞首先进入G1期，在这一期间，细胞内RNA含量增加，合成细胞所需的蛋白质,此时细胞不合成DNA。

S期(DNA合成期):一旦细胞开始合成新的DNA，细胞则进入了S期。

G2期(分裂前期):DNA复制完成到有丝分裂开始的时间区间，即细胞DNA倍增结束，细胞开始进入G2期，又称为DNA合成后期。

M期(分裂期):随后细胞进入分裂期，即M期。时间区间指从有丝分裂开始到结束。

G0期(静止期):有些细胞会暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一些功能，称为G0期细胞。;(3)流式细胞术测量DNA含量的变化与倍体关系

1)G0期（静止期）细胞:DNA含量为恒定的2倍（2C）;

2)G1期细胞:DNA合成前期，细胞为进入S期做物质准备，合成大量的蛋白质和RNA。DNA含量与G0期相同，(2C);

3)S期细胞:DNA合成期，当细胞进入S期后DNA含量逐渐增加，从2C～4C;

4)G2期与M期细胞:DNA合成后期和分裂期。S期后细胞DNA含量倍增，细胞进入G2期，尔后最终进入M期；在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C。;;;当进行DNA染色时，荧光染料（如PI）与细胞DNA分子特异性结合，而且有一定的量效关系：

1）DNA含量的多少与荧光染料结合成正比；

2）荧光强度与荧光染料分子多少成正比；

3）荧光强度与直方图中的通道数值(C)成正比。因此，在用FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周期时，荧光的道数直接与DNA含量有关。;CV值（变异系数）：实测DNA含量直方图的G0/G1期峰为正态分布，测定过程存在一定的漂移，为精确解释这种漂移现象，在FCM分析DNA含量中引入了变异系数（CV值）。

实测结果的CV值包括仪器的CV值和实验样品的CV值。在实验过程中，一个生物细胞的CV值在5％以下的精度就足够了。;100％均为二倍体细胞（DIPLOID)。其中G0/G1占99%,无G2/M期细胞,S期细胞0.01%,G0/G1细胞峰CV值为2.94％。;二倍体细胞占58.86%；G0/G1细胞峰CV值为3.39％。可见一个异倍体细胞峰为亚二倍??，占41.14％。DNA指数为0.81%。;多发性骨髓瘤骨髓细胞DNA分析;第二节:流式细胞术在细胞凋亡检测方面的应用;一、概述：

细胞凋亡（apoptosis）又称细胞的程序性死亡(programmedcelldeath)，是细胞在一定生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，它是一个主动的、高度有序的、基因控制的一系列酶参与的过程。细胞凋亡在形态上和生化上有其明显的特征。;;细胞凋亡的分析;细胞凋亡——Caspases-3;ANNEXIN-V/PI检测;流式细胞仪检测细胞凋亡——AnnexinV/PI双染色法;结果判断;第三节:流式细胞术在淋巴细胞免疫表型分析的应用;一、概述：

正常机体内淋巴细胞是不均一的细胞群体。根据其表面标志及功能特点，可分为不同的亚群。从体液免疫及细胞免疫功能分，淋巴细胞可分为B淋巴细胞与T淋巴细胞两大类。此外，有一种大颗粒淋巴细胞，由于缺乏T和B细胞的独特的标志（TCR、BCR）故称为第三类淋巴细胞即：（NK）细胞。

再根据细胞表面分化抗原（clusterofdifferentiation;CD）的表达可将他们进一步分成许多的亚类。;（二）可归入T细胞组的CD有：CD3、CD4、CD8、CD11a/CD18、CD49/CD29、CD28、CD2、CD45、CD5、CD44等。

其中，CD3与CD2（还有TCR）分子是外周血成熟T淋巴细胞各亚群共有的表面标志。

而CD4、CD8表达是成熟T细胞不同亚群的表面标志。;CD4在T细胞活化中有两个主要功能：

一是作为细胞间的粘附分子，与MHCII类分子的?2功能区结合以稳定T细胞与APC细胞结合；

另一功能是CD4分子的胞浆区与蛋白酪氨酸激酶p56lck相连。从而激活T细胞作用。

因此其主要功能为T辅助作用（Thelper,Th）细胞）或称T诱导作用（inducelymphcytes,Ti）。;CD8在T细胞活化中也有两个主要功能：

一是作为细胞间的粘附分子，与MHCI类分子结合以稳定T细胞与靶细胞结合。为抑制性（杀伤性）T淋巴细胞；

另一功能是CD8分子也与