AFP基因表达的检测.pptVIP

AFP基因表达检测;甲胎蛋白DNA序列;mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。

;被污染的试剂，缓冲液

移液器

使用的器皿及tip等

操作者的手，头发等

;当处理RNA时，移液器专用

保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用；

溶液和试剂分装成小份保存；

RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗）；;准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用0.1％的DEPC在37oC处理溶液1小时后在15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。

180－300oC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品；

使用新的、无RNA酶的一次性tubes,tips等；

在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。;

材料要新鲜;

裂解过程要同RNase活性抑制同步;DEPC:;RNA提取;实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量

实验材料：水HCC患者的外周血单核细胞（PMNCs）AFPmRNA;1.外周血单个核细胞(PMNCs)的分离取受检者外周血5ml,肝素抗凝。采用密度梯度离心法,用淋巴细胞分离液分离收集PMNCs。

2..PMNCs的总RNA的提取

用TrizolRNA提取液(GIBCOBRL),以改良的异硫

氰酸胍-酚-氛仿一步法提取总RAN,放-80℃保存。

并抽提HepG2细胞株的总RNA,放-80℃保存;RNA降解的主要原因;RNA污染的原因;RT-PCR

(ReversetranscriptionPCR);PCR技术;模板DNA：一般102－105个拷贝

Mg2＋：Mg2＋能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般反应体系中1.5-2.5mmol/L

反应反冲液：使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。

dNTP：在PCR反应体系中其浓度一般为20－200?mol/L，浓度过高、过低都不利。

TaqDNA聚合酶：在70－75?C具最高活性。具有5’－3’的聚合酶活性和5’－3’的外切酶活性，无校正功能。是镁依赖性酶。

引物：PCR反应中引物浓度一般为0.1－0.5?mol/L。;RT-PCR;取1μg总RNA加入随机引物0.5μg,70℃温浴5分钟,

迅速放置冰浴中,再加入2.5mMdNTP4μl,RNA酶抑制剂25u,5xRT缓冲液5μl,MMLV逆转录酶(Promega)200u,加DEPC处理水至总体积25μl。

37℃温浴1小时,迅速放于冰中,-80℃冰箱保存。;再加入10xPCR缓冲液5μl,25mMMgCl2溶液3μl,TaqDNA聚合酶2u,加去离子水至总体积50μl。94℃变性30秒,59.5℃退火30秒,72℃延伸40秒,共进行30个循环,末次循环后72℃延伸7分钟。;同时以HepG2总RNA作为阳性对照、水作为阴性对照进行扩增,排除假阳性和假阴性的情况。

;Taq酶过多；

Mg2+浓度不合适；

引物浓度过高或设计不合理；

复性温度过低；

循环次数过多；

模板量过多；;点样或染胶问题

反应体系中忘记加入某种成分(无扩增产物）或分装mixture时出了问题；

目的片段太大，使用的DNAPolymerase无法扩增出目的片段；

DNA溶液中或反应体系中含有Taq酶抑制剂，抑制了TaqDNA聚合酶的活性。

退火温度太高；

Taq酶活力不够或其他试剂有问题；

引物设计不合理，与模板不配对等。